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第一部分miRNA-126及EPCs在子痫前期发病机制中的作用目的探讨miRNA-126在子痫前期患者脐血EPCs及胎盘组织中的表达及其与胎盘血管形成中的作用。方法1.分离、培养对照组和子痫前期组脐血EPCs,利用细胞形态学和免疫荧光染色(DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I)检测鉴定EPCs纯度,并观察记录群落计数及群落直径；2.采用逆转录聚合酶链反应检测脐血EPCs及胎盘组织miRNA-126的表达；3.采用相关性分析脐血EPCs及miRNA-126的表达；4.采用免疫组织化学染色检测胎盘组织血管密度。结果1.分离培养单个核细胞,培养7天后可见细胞呈集落样分布,中心为圆形细胞,在其周围为纺锤形的细,,此类型集落被称为colony-forming units(CFUs)。荧光显微镜下细胞呈现FITC-UEA-I(绿色荧光)和DiI-ac-LDL(红色荧光)双染色阳性,此时期的细胞为正在分化的早期EPC。子痫前期组脐静脉血中EPCs数量(77±13)明显低于正常孕妇组(136±23)；对照组脐血EPCs集落数量较子痫前期组明显升高(8.7±2.2和4.3±1.3),且对照组CUFs群落直径明显高于子痫前期孕妇。2.子痫前期脐血EPCs中miR-126表达量(0.55±0.36)明显低于对照组(1.0±0.15)；子痫前期胎盘中miR-126表达量(0.38±0.22)明显低于对照组(0.88±0.25)。3.子痫前期组EPCs数量及miR-126表达水平呈现正相关(r=0.65,P<0.05)。对照组EPCs数量及miR-126表达水平无相关性。4.子痫前期组孕妇胎盘的微血管数量(54.8±5.72)较正常组孕妇胎盘的微血管数量(77.6±7.92)显著减少；脐血管S/D比值子痫前期组(3.08±±0.95)明显高于正常组(2.37±0.63)(p均<0.05),见表1。结论子痫前期患者脐血中EPCs数量及群落明显减少,EPCs中miR-126表达下降可能与胎盘血管减少,子痫前期的发生密切相关。第二部分miR-126对EPCs功能及血管新生的调控作用目的研究上调miR-126的表达对EPCs细胞增殖、分化、迁移和菌落形成能力的影响,了解miR-126在EPCs形成血管过程中的作用。方法1.分离、培养子痫前期患者脐血EPCs,将细胞分为实验组(转染niR-126mimic)、阴性对照组(转染mimic control)和空白对照组(不进行细胞转染)3组；2.采用实时荧光定量PCR技术检测miR-126的表达,了解转染效率及过表达的效率；同时,采用PCR技术检测miR-126下游基因PIK3R2和P13K的mRNA表达水平。3.采用免疫印迹技术检测miR-126下游基因PIK3R2和P13K蛋白的表达；4.采用MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)比色法测定转染后的细胞活力：5.采用Transwell模型迁移实验检测转染后细胞的迁移能力；6.采用重悬贴壁法检测转染后细胞的分化能力及菌落形成能力结果1.转染后miR-126mimic的EPCs在荧光显微镜下可见强的红色荧光,荧光阳性细胞占总细胞数的90%以上。对照组中无荧光表达。转染后EPCs中miR-126的表达水平分别为实验组7.5±1.8,阴性对照组3.8±2.2、空白对照组miR-126(3.3±1.5)：2.空白对照组、阴性对照组、实验组下游基因PIK3R2的mRNA表达水平分别为1.0±0.32,1.34±0.29和0.25±0.28。下游基因P13K的mRNA表达水平分别为0.46±0.22,0.54±0.27和0.85±0.23。下游基因的蛋白表达水平趋势与mRNA的表达水平趋势一致。实验组与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.转染24小时后EPCs的细胞活力,实验组的吸光度A值为(0.78±0.12),阴性对照组为(0.46±0.07),空白对照组为(0.53±0.09)。实验组的A值与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。4.转染24小时后空白对照组、阴性对照组、实验组迁移入Transwell小室下室的细胞总数分别为：84.2±2.7、93.2±3.1和136.4±2.5个。实验组高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。转染miR-126能明显增强EPCs的迁移能力。5.转染24小时后,计数梭形细胞数目,实验组为(96.1±10.3)个,阴性对照组为(53.2±11.3)个,空白对照组为(47.4±9.6)。各组间比较,实验组与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-126表达水平的升高可以上调EPCs的增殖、迁移和分化能力。第三部分局部转染niiRNA-126改善子痫前期大鼠胎盘灌注目的通过agomir-126局部转染模型大鼠胎盘,观察转染agomir-126后胎盘形态学和微血管密度等方面的变化,探讨miR-126在改善孕鼠胎盘血管生长的可能作用和机制。方法1.利用L-NAME建立高血压孕鼠模型；2.模型鼠分组,并采用胎盘局部注射转染技术将agomir-126转染入孕鼠胎盘组织；3.转染后的孕鼠组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察agomir-126表达以了解转染效果；4.采用超声微泡技术实时测量孕20天大鼠胎盘血流灌注5.处死大鼠,测定胎盘、胎鼠的大小、重量及外观；6.利用实时荧光定量PCR检测转染后孕鼠胎盘组织miR-126的表达水平；7.利用CD31因子免疫组化实验检测孕21天大鼠转染后的胎盘血管密度。结果1.实验选取的21只孕鼠,麻醉及感染死亡1只,早产1只；其余孕鼠均存活,于妊娠第21天剖腹取胎。2.转染后胎盘组织的冰冻切片在荧光下观察可见红色Cy3大面积高表达,体内转染效果理想；3.孕D15子痫组和治疗组血压均高于对照组(p<0.05)；D20时子痫组的血压高于对照组和治疗组,子痫组和治疗组间差异无显著性(p>0.05)。4.超声微泡实时胎盘造影可清楚显示胎盘的大小,直径以及血流灌注情况。二维常规超声下测量三组胎盘最大切面的面积,子痫组的切面面积明显小于其它两组,且超声微泡造影下第8秒图像显示子痫组的充盈程度明显低于其它两组。大鼠胎盘的时间一强度曲线显示子痫组的到达时间(AT)和达峰时间(TTP)均晚于对照组和治疗组(P<0.05),治疗组曲线与对照组较为一致,但到达时间(AT)略晚于对照组。5.体内转染后,三组的胎鼠重量(g)分别为：对照组5.26±0.06,子痫组4.15+0.08,治疗组5.04±0.11；三组的胎盘重量(g)分别为：对照组0.60±0.03,子痫组0.43±0.02,治疗组0.52±0.04；三组的胎盘直径(cm)分别为：对照组1.43±0.14,子痫组1.25±0.18,治疗组1.40±0.11。子痫组的胎盘胎鼠明显小于其它两组,且子痫组的胎盘外观较其它两组胎盘苍白。治疗组与子痫组相比较,胎鼠重量和胎盘重量差异具有统计学意义和胎鼠重量(p<0.05)。6.转染后各组胎盘中miR-126的表达水平,治疗组为4.2±0.31,对照组为1.0±0.27,子痫组为0.693±0.16。各组分别比较,治疗组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；对照组与子痫组差异有统计学意义(P<0.05)。7.对照组和治疗组的绒毛间质疏松,CD34染色阳性率高;子痫组的绒毛间质稍密,CD34表达降低(×200)。治疗组孕鼠胎盘的微血管数量(69.2±4.15)较子痫组(39.1±5.34)显著增多；治疗组与对照组(76.44±5.23)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用miR-126类似物agomir-126在胎盘内转染技术可有效增加miR-126在孕鼠胎盘的表达水平,且能够增强孕鼠胎盘的血管形成能力,改善子痫前期孕鼠模型的妊娠结局,提示miR-126有望成为胎盘促血管新生的新靶点。