本论文分为两个部分:1.单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗的合成;2.1a型B族链球菌荚膜多糖重复单元构建砌块的合成。单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗的合成:肿瘤是严重威胁着人类生命健康的常见病和多发病,是人类死亡的第二病因。其中以肿瘤细胞表面异常表达的肿瘤相关糖抗原(Tumor-associated carbohydrate antigens TACAs)为靶点的糖疫苗,具有特异性高、副作用小、有改善或者治愈肿瘤的潜力等优点,是治疗性抗肿瘤的理想方式。TACAs属非T细胞依赖性抗原,只能活化B细胞,产生一种低亲和力IgM抗体,不能产生高亲和力的IgG抗体。为了使糖抗原能在体内产生特异性T细胞免疫应答,传统策略是将糖抗原与含有T细胞表位的载体蛋白共价连接制成糖蛋白疫苗,当糖蛋白疫苗进入机体后,能被抗原提呈细胞识别并呈递给T细胞,使T细胞活化,诱导B细胞增殖并产生IgG抗体,同时产生具有免疫记忆的B细胞,从而特异性地杀伤肿瘤细胞。但糖蛋白疫苗具有糖抗原与载体蛋白偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂和载体蛋白产生的免疫反应会压制对TACAs的免疫反应等缺点。为了克服这些缺点,将TACAs与内源性佐剂共价连接的化学全合成糖疫苗具有化学结构清楚、组成成分明确、无载体蛋白的免疫反应等优点,是目前抗肿瘤疫苗的主攻方向。并且已证明:TLR(Toll-like receptor)激动剂作为内源性佐剂,可以将糖抗原提呈到相应的免疫细胞,从而产生针对糖抗原免疫应答。目前用于内源性佐剂的载体分子主要有各种亚型TLR的激动剂,其中MPLA(Monophosphoryl lipid A)是最主要的TLR的激动剂之一。而且,MPLA被用作疫苗载体与多种糖抗原偶联成二组分疫苗,表现出很好的抗肿瘤活性。对MPLA进行结构优化与改造中,发现了结构更为简单、活性更优的第二代MPLA衍生物RC-529,且RC-529作为疫苗佐剂,其临床作用已经在重组乙肝抗原的Ⅲ期临床试验中得到了证实。因此,本课题结构以RC-529及其衍生物为载体与广谱糖抗原Tn缀合成二组分糖肿瘤疫苗,研究RC-529及其衍生物作为糖疫苗载体的活性。我们共设计合成了四个单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤候选疫苗(图1)。Ia型B族链球菌荚膜多糖五糖重复单元构建砌块的化学合成:B族链球菌(group B streptococcus,GBS)是造成新生儿中细菌性败血症和脑膜炎的主要原因之一。根据GBS表面荚膜多糖结构差异已鉴定出有10种血清型,其中血清型Ia型GBS与新生儿中36%的早发性疾病有关,其中Ia型B族链球菌的荚膜多糖由末端含有唾液酸的五糖重复单元组成(α-D-Neup5Ac-(2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→。由于唾液酸的糖苷化反应立体选择性和产率较差,化学全合成比较困难。因此,我们准备用化学合成与酶法合成相结合的方法,来制备该重复单元。我们以化学合成的三糖化合物为起始原料,然后再经过两步酶接反应高效、快捷地得到五糖重复单元。为后期对Ia型B族链球菌荚膜多糖生物功能研究提供物质基础。我参与的主要工作是构建块三糖化合物的全合成,酶法合成正在进行中。实验内容与合成路线:1.单磷酸类酯A缀合Tn抗肿瘤疫苗的合成1.1 Tn糖抗原的合成:以N-乙酰-D-半乳糖胺为起始原料,在2-氯乙醇和乙酰氯的作用下50℃反应得到α构型的化合物H-1,以吡啶为溶剂和催化剂对羟基乙酰化得到化合物H-2,再与叠氮钠反应得到化合物H-3,用甲醇钠脱去3,4,6位的乙酰基得到化合物Tn。1.2RC-529及其衍生物与肿瘤糖抗原Tn二组分疫苗的合成1.2.1脂肪酸3-R-十四烷酰氧基十四烷酸及其衍生物的化学合成:以1-溴癸烷为起始原料制备格式试剂与R-环氧氯丙烷在碘化亚铜催化下得到重要中间体2-十一烷基-(2R)环氧乙烷,再经过三步得到脂肪酸化合物。1.2.2 RC-529及其衍生物与肿瘤糖抗原Tn二组分疫苗的合成:以D-葡萄糖胺盐酸盐为起始原料,根据葡萄糖上羟基的反应活性不同,按照合理的保护基策略和路线设计,通过16步反应得到四个RC-529衍生物,RC-529衍生物的炔基和抗原Tn上的叠氮在碘化亚铜、N,N-二异丙基乙胺的催化下“click”反应缀合,最后脱去保护基得到四个单磷酸类酯A缀合Tn候选疫苗(MLL-2-67)6-氧-{[1-(2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)乙基-5-亚甲基]-1,2,3-三氮唑基}-1-氧-{2-[3-R-(十四烷氧基)十四烷酰胺基]乙氧基}-4-氧-磷酸酯基-2-去氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-3-氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-β-D-葡萄糖苷、(MLL-2-68)6-氧-{[1-(2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)乙基-5-亚甲基]-1,2,3-三氮唑基}-1-氧-{2-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]乙氧基}-4-氧-磷酸酯基-2-去氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-3-氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-β-D-葡萄糖苷、(MLL-2-69)6-氧-{[1-(2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)乙基-5-亚甲基]-1,2,3-三氮唑基}-1-{2-[3-R-(十二烷酰氧基)十四烷酰胺基]乙氧基}-4-氧-磷酸酯基-2-去氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-3-氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-β-D-葡萄糖苷、(MLL-2-70)6-氧-{[1-(2-去氧-乙酰基-α-D-半乳糖苷基)乙基-5-亚甲基]-1,2,3-三氮唑基}-1-{2-[3-R-(十二烷酰氧基)十二烷酰胺基]乙氧基}-4-氧-磷酸酯基-2-去氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-3-氧-[3-R-(十四烷酰氧基)十四烷酰胺基]-β-D-葡萄糖苷。2.Ia型B族链球菌荚膜多糖重复单元三糖片段MLL-159的化学合成:首先合成三个单糖化合物(MLL-13、MLL-86、MLL-149)然后再依次进行糖基化反应得到目标三糖化合物。具体实验过程为:把MLL-13和MLL-86在N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸、分子筛的存在下发生糖苷化取代反应得二糖MLL-89;以氰基硼氢化钠为催化剂,4-甲基橙为指示剂,在盐酸乙醚的作用下选择性断开4位醚键得到化合物MLL-95;和MLL-149在N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸,分子筛的存在下发生糖苷化取代反应得到全保护的三糖化合物MLL-151;用乙二胺回流脱去乙酰基、苯甲酰基、邻苯二甲酰基保护基团;用冰乙酸和水50℃脱去4,6的苯甲亚基;以吡啶为溶剂用乙酸酐对所有羟基和氨基进行乙酰化;用甲醇钠甲醇混合物脱去化合物的乙酰基;最后用氢气和钯碳脱去保护基苄基;把叠氮基还原成氨基得到目标产物MLL-159。用核磁、质谱等结构分析手段,对合成的化合物进行了鉴定,表明本文设计合成的化合物结构正确。