【摘 要】
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本研究以BALB／c小鼠为材料，建立免疫外科分离克隆小鼠ES细胞方法；并以牛胎儿为材料，从牛原始生殖细胞中分离克隆出牛EG细胞。对影响小鼠ES细胞、牛EG细胞分离与克隆的影响因素进
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本研究以BALB／c小鼠为材料，建立免疫外科分离克隆小鼠ES细胞方法；并以牛胎儿为材料，从牛原始生殖细胞中分离克隆出牛EG细胞。对影响小鼠ES细胞、牛EG细胞分离与克隆的影响因素进行了探讨，为进一步建立小鼠ES及牛EG细胞系奠定了基础。实验主要结果如下： 1．用免疫外科法从45枚BALB／c小鼠囊胚中分离得到20枚除去滋养层细胞的ICM，接种在MEF饲养层上，使用DMEM(高糖)+15％FBS+0.1mMβ-巯基乙醇+0.01mM非必需氨基酸+1000 IU／ml LIF+100 IU／mL青霉素+100 IU／ml链霉素培养液，17枚形成典型的ICM集落，有一枚胚胎传至第10代。用于全胚培养的BALB／c小鼠胚胎共102枚，使用与免疫外科相同的培养方法，66枚形成典型的ICM集落，其中一枚胚胎传至第8代。 2．收集妊娠29～100d牛胎儿46例，使用DMEM(高糖)+15％NBS(或FBS)+0.1mMβ-巯基乙醇+2mM谷氨酰胺斗0.01mM非必需氨基酸牛100 IU／mL青霉素+100 IU／ml链霉素培养液从生殖嵴(腺)或类似物原始生殖细胞中分离克隆牛EG细胞，25例出现EG细胞集落，最高一例传至6代。胎龄为29～45d牛胎儿最适合牛EG细胞分离与克隆，胎龄大于70 d，很难得到牛EG细胞。 3．从45d牛胎儿中分离培养出牛胎儿成纤维细胞，传至28代。发现α-MEM是一种很好牛胎儿成纤维细胞分离培养的培养基。 4．小鼠胚胎贴壁率及ICM集落形成率在MEF、STO及BEF三种饲养层上无显著差异(P＞0.05)；MEF、STO、BEF及HEF饲养层均能促进牛EG细胞体外增殖，但STO效果最好，MEF及BEF次之，HEF效果最差。 5．DMEM培养基对牛PGCs的分离培养及传代明显好于F12；15％NBS在小鼠胚胎贴壁率及ICM集落形成率上明显好于10％NBS(P＜0.05)；15％FBS较15％NBS有利于小鼠ES细胞(P＜0.05)、牛EG细胞的分离与克隆。 6．添加LIF(10ng／ml)有利于小鼠ES细胞(P＜0.05)、牛EG细胞的分离与克隆；LIF、SCF及bFGF(添加浓度均为10 ng／ml)三种因子联合作用能明显促进牛EG细胞分离克隆。 7．BALB／c小鼠ES细胞对胰酶很敏感，0.05％胰酶+0.008％EDTA是较好的ES细胞消化液，对细胞综合损伤力小，且传代后ES细胞集落形成能力也较高(P＜0.05)。 分离得到的小鼠ES细胞、牛EG细胞，经形态学观察，AKP(或PAS)染色，体外分化实验，核型分析证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。
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