华支睾吸虫病(clonorchiasis)又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)感染引起的一种人兽共患病，也是我国常见的食源性寄生虫病。华支睾吸虫病广泛流行于东亚地区和我国大部分地区，以广东省流行最为严重。全国现有肝吸虫感染者1249万，其中广东省占500多万。广东省有81个县市流行肝吸虫病，珠江三角洲地区流行最为严重，个别地区人群感染率高达85％，并呈逐渐上升的趋势。华支睾吸虫病由寄生于人体肝胆管内的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)引起，可产生严重的肝胆并发症，与胆管癌的关系也非常密切。 华支睾吸虫成虫可长期寄生于人的肝胆管内，对肝胆系统造成慢性损伤，引起胆管局限性扩张、胆管炎、胆管上皮细胞腺瘤样增生、肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤，是广东省重点防治的地方病之一。作为我国最重要的食源性寄生虫病，引起了国家的高度重视，被列为国家重点防治的目标疾病之一。 华支睾吸虫病的正确诊断是防治的关键。华支睾吸虫病的实验室诊断主要包括病原学方法和免疫学方法。目前华支睾吸虫病的诊断主要依靠病原学检查和免疫学检测，两种检查方法各有其利弊。病原学检查以粪便镜检虫卵为主要方法。由于在人体内寄生的虫数一般不多，排卵数量较少，虫卵形态又非常小，该法极易漏诊，且操作费时费力，不适合大规模的流行病学调查。 免疫学诊断技术因其具有较高的敏感性和特异性，操作简便易行，近年来已成为华支睾吸虫病的最常用的辅助诊断手段，在临床辅助诊断和流行病学调查中发挥了越来越重要的作用。目前，华支睾吸虫病免疫学诊断方法分为检测抗原和检测抗体两大类，后者较为稳定、可靠，检出率高，使用较为普遍，其中尤以检测血清中特异性抗体的ELISA以及基于ELISA的改进方法最为常见。 ELISA方法具有高度的敏感性和特异性，操作简便，无需特殊仪器设备，血样用量少，结果容易判断，适合现场应用，是目前流行病调查和临床诊断中应用最为广泛的免疫诊断方法。 用于抗体检测的诊断抗原直接影响着检测的效果，包括检测的敏感性和特异性。因此，一直成为免疫学诊断的研究重点。目前用于华支睾吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒所使用的抗原包括成虫粗抗原、虫体分泌、排泄抗原等，但这些复合抗原存在假阴性和假阳性率都比较高，且抗原的来源困难和难以标准化的问题。因此，应用成分明确的重组抗原替代粗抗原是免疫诊断试剂盒研制的必然趋势。关于华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选和评价是国内外华支睾吸虫病研究的重点，也是本实验室近年来对华支睾吸虫研究的主要目标之一。 本实验室近年来一直致力于华支睾吸虫的研究，也已发现鉴定了一批华支睾吸虫的基因，鉴于目前免疫诊断上假阴性和假阳性率均较高的问题，我们设想，如果借助生物信息学的方法将许多华支睾吸虫基因中的特异性抗原表位组合在一起，形成一个新的多抗原表位复合物，是否可以同时解决假阴性和假阳性率均较高的问题。 研究目的： 利用生物信息学方法发现华支睾吸虫特异性的抗原表位，人工构建华支睾吸虫特异性多表位复合抗原基因，并通过基因工程技术进行克隆和表达，制备重组抗原，分析其抗原性。 研究方法： 1、华支睾吸虫多基因的生物信息学分析、特异性表位的选取及合成 用PCGENE及BLASTX方法从本室已克隆表达的18个华支睾吸虫基因中选择出18个华支睾吸虫特异性抗原表位，运用Overlapping PCR技术合成多表位的编码基因MSE(multiple-specific-epitope)。 2、MSE基因的育隆、表达及纯化 将MSE基因先后克隆到pET30a和pGEX-4T-1表达载体中，构建的重组质粒分别经PCR、双酶切及测序进行鉴定。后将重组质粒分别转化入大肠埃希菌BL-21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达情况，亲和层析纯化目的蛋白。 3、Western blotting分析MSE的抗原反应性 将MSE抗原通过Western blotting方法转至PVDF膜上，用华支睾吸虫感染大鼠的阳性血清及未被华支睾吸虫感染的大鼠阴性血清和膜共孵育，观察MSE的抗原反应性。 研究结果： 1、华支睾吸虫多基因的生物信息学分析、特异性表位的选取及合成 用PCGENE及BLASTX方法从本室已克隆表达的18个华支睾吸虫基因中选择出18个华支睾吸虫特异性抗原表位，DNEKFD、DDDEDRER、DDKYDER、DDSQKK、KLEEERRL、KKDPAR、ELRDDNGND、SMDDRKTTR、NDELEK、EKPPEERR、RSRDES、SESHRR、KDSHPDEE、KGERTK、ETEGRKRMVR、RDLTER、DKTDEELKR、DADNRE，我们人工设计了12条引物，通过Overlapping PCR技术将编码这些特异性抗原表位的序列串联组合在一起，形成编码MSE蛋白的序列。合成序列经测序证实构建成功。 2、MSE基因的克隆、表达及纯化 将MSE基因先后定向克隆到pET30a和pGEX-4T-1表达载体中，构建的重组质粒分别经PCR、双酶切及测序进行鉴定。后将重组质粒分别转化入大肠埃希菌BL-21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达情况，pET30a重组质粒未见预期的融合蛋白表达，pGEX-4T-1质粒的菌株诱导表达后可见大小为46kDa的蛋白特异性表达，与预期的融合蛋白分子量一致。该融合蛋白以上清形式表达，沉淀中几乎无诱导表达的融合蛋白。用GST亲和层析柱纯化目的蛋白成功。 3、Western blotting分析MSE的抗原反应性 MSE在pGEX-4T-1载体中能与GST标签一起形成GST-MSE融合蛋白，该蛋白可溶性表达，但经凝血酶酶切后MSE易降解，故只能以GST-MSE融合蛋白形式研究其免疫学性质。经纯化后Western blotting检测，显示此重组蛋白能与抗GST单抗血清及华支睾吸虫感染的大鼠阳性血清发生抗原抗体反应，不能与阴性的大鼠血清反应。 研究结论： 该多表位重组蛋白MSE为高度亲水性的蛋白，理化性质很不稳定，溶液中极易降解；GST伴侣蛋白可以提高其稳定性，融合重组蛋白GST-MSE具有抗原性，可与华支睾吸虫感染的大鼠阳性血清发生抗原抗体反应，不能与阴性的大鼠血清反应。