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白桦(Betula Platyphylla Suk)的树皮中含有三帖类化合物白桦脂醇、白桦脂酸、齐墩果酸等,具有抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗疟疾等药物活性。纯天然白桦次生代谢产物含量低,化学合成成本高,制约其在生产实践中的应用。细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,CYP450)是参与植物代谢的最大酶家族,催化三萜骨架形成具有各种功能的官能团,如羟基、羰基和羧基等,在三萜骨架结构多样化及功能化修饰中具有关键作用。本研究拟克隆响应SA和MeJA信号的白桦BpCYP450基因,结合MeJA、SA、ABA等诱导,明确BpCYP450基因与三萜合成关键基因的表达特征,探究5个BpCYP450基因在烟草和白桦中的表达特性及三萜合成中的功能。研究结果如下:1.以白桦cDNA为模板,应用特异性引物结合RT-PCR技术,克隆获得5个白桦BpCYP450基因cDNA全长,分别命名为CYP94B89、CYP8S1、CYP97B2、CYP86B54和CYP86A182。生物信息学分析结果表明,5个基因的开放读码框(open reading frame,ORF)长分别为 1284bp、1533bp、1188bp、1704bp 及 1539bp,分别编码 427、510、395、567及512个氨基酸,均具有CYP450保守区域及跨膜结构。CYP94B89、CYP97B62、CYP86B54和CYP86A182所编码的蛋白质分别与欧洲栓皮栎CYP94B3、CYP97B2、CYP86B1和CYP86A32蛋白相似性最高,分别为85%、89%、81%和86%,CYP89S1所编码的蛋白质与黄灯笼辣椒CYP89A2蛋白相似性最高为45%,结合多序列比对及发育进化树结果表明,本研究获得的5个基因为白桦细胞色素P450家族中的新成员。2.利用实时定量PCR技术,分析BpCYP450和白桦三萜合酶基因组织特异性及MeJA、SA、GA3、ABA、乙烯、机械损伤处理表达模式。结果表明,CYP89S1、CYP97B62、BpSE和BpDS基因在叶中的表达水平最高,CYP86B54、CYP86A182、BpSS、BpW及BpY在根和茎中表达量较高,CYP94B89基因在茎中相对表达量最高。BpCYP450和白桦三萜合酶基因对不同激素的诱导响应模式不同。MeJA主要诱导BpY、CYP89S1、BpSS、BpDS、CYP97B62和基因表达,SA主要诱导CYP86A182、CYP8654和CYP89S1基因表达,GA3主要诱导BpY、BpW和CY89S1基因表达,ABA主要诱导CYP86B54、CYP89S1、CYP94B89和BpY表达,乙烯和机械损伤主要诱导CYP89S1和BpY基因表达。分析5个BpCYP450和白桦三萜合酶基因对激素诱导的共表达趋势,结果表明,MeJA、SA、GA3、乙烯及机械损伤能够诱导CYP94B89、CYP86B54和BpDS表达趋势高度相似,GA3和乙烯能够诱导CYP86A1182基因在茎中与BpW表达趋势相似,GA3、机械损伤能够诱导叶中CYP89S1分别与BpSS、BpSE表达趋势相似,此外叶中CYP89S1经SA诱导与BpSS、BpY、BpW具有相似的表达趋势,以上结果表明,4个BpCYP450基因与部分三萜合酶基因对激素诱导存在协同作用。3.利用染色体步移技术获得CYP94B89、CYP89S、CYP89S1、和CYP86A182基因启动子,长度分别为778bp、791bp、843bp及1057bp。通过PlantCare数据库预测BpCYP450的结合位点和功能,结果发现,CYP94BB9、CYP9S1、CYP86B54及CYP86A182启动子序列中存在启动子基本转录元件TATA-box和CAAT-box并位于多个位点。4个BpCYP450启动子均具有MeJA响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif。同时,CYPPS1、CYP8B54及CYP86A182启动子还具有GA响应元件,此外,还发现了CYP94B89启动子序列中的ABA响应元件ABRE,CYP86B54启动子中的SA响应元件TCA-element。CYP89S1、CYP86B54及CYP86A182启动子中均含有能够结合MYB位点的MBS顺式作用元件。利用农杆菌介导BpCYP450基因、启动子与白桦转录因子BpMYB21基因在本氏烟草中瞬时表达,初步明确BpMYB21转录因子可能与CYP94B89、CYP86B54和CYP86A182启动子结合,上调这3个BpCYP450基因表达。4.为进一步验证5个BpCYP450基因对三萜合成的功能,利用瞬时侵染方法将白桦CYP94B89、CYP89S1、CYP97B62、CYP86B54、CYP86A182与白桦三萜合酶基因BpW和BpY在烟草中共表达。结果表明,CYP97B62和C]P86A182能够上调BpW基因的表达。CYP97B62和CYP86A182基因过表达的本氏烟草中,白桦脂醇的含量较高,分别为3.23 mg/g和3.15mg/g,是野生型烟草的1.50倍和1.46倍,白桦脂酸的含量分别为0.45 mg/g和0.43 mg/g,是野生型烟草的12.36倍和11.91倍。白桦脂醇和白桦脂酸的含量在BpW+CYP89S1+CYP9762+CYP86B54+CYP86A182共表达的烟草中最高,分别为3.99 mg/g和0.49mg/g,分别是野生型烟草的1.85倍和13.62倍。BpW+CYP89S1共表达的烟草中,白桦脂酸的含量均高于BpW和CYP89S1基因分别过表达的烟草,是野生型烟草的8.99倍。以上结果说明,CYP97B62和CYP8A182在白桦脂醇和白桦脂酸的合成中具有重要作用,CYP89S1在白桦脂酸合成中具有功能,推测CYP89S1、CYP97B2、CYP86A182可能促进羽扇豆醇转化为白桦脂醇和白桦脂酸。5个BpCYP450与BpY基因共表达的本氏烟草中,齐墩果酸的含量显著低于野生型烟草,通过对代谢产物分析,推测5个BpCYP450可能将齐墩果酸转化为其他三萜物质。5.成功获得CYP89S1过表达的白桦抗性植株8株,经PCR初步鉴定5株为阳性CYP89S1转基因植株。其中,CYP89S1-5株系中,CYP89S1基因的超量表达效果最好。利用QPCR技术检测CYP8S1-5转基因白桦苗中三萜途径关键酶基因BpSS、BpSE、BpW、BpY及BpDS基因的表达特征,三萜途径关键酶基因BpSS、BpSE、及BpW相对表达量均被上调,其中BpW上调效果最为明显,BpDS和BpY基因的相对表达量被下调,以上结果表明,CYPP8S1基因过表达后,Bpw基因显著上调,这与CYP89S1、BpW在烟草中瞬时表达促进白桦脂酸含量提高结果吻合。