黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）作为典型的+ssRNA病毒，是寄主最多、分布最广、对农作物危害最为严重的植物病毒之一；由于基因组分布在3条RNA分子，基因组结构简单，CMV是研究RNA病毒致病机制的模式病毒之一。本论文就CMV的2b基因与satRNA互作进行以下方面的研究：1．黄瓜花叶病毒褪绿分离物基因组全长克隆及侵染性克隆构建杭州郊区的辣椒样品经ELISA检测和SDS-PAGE病毒粒子分析，结果表明：引起大田辣椒产生褪绿黄化症状的病原物为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV），CMV-Phy。CMV-Phy病毒粒子RNA分析发现该CMV携带satRNA（satellite RNA，satRNA）。将辣椒样品汁液摩擦接种于心叶烟，接种14 d（days post-inoculation，dpi）所引起的症状与CMV-Phy症状相似。以病毒粒子的RNA为模板，在一个RT-PCR反应中通过升温PCR同时获得CMV-Phy基因组RNA1、RNA2和RNA3的cDNA。5种感受态细胞与CMV-Phy基因组cDNA连接产物（pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3）进行转化结果表明：HB101最适合CMV-Phy的转化。测序结果显示pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3大小分别为：3356 nt（nucleotide，nt），3048 nt和2220 nt（序列登陆号分别为：DQ402477，DQ41273和DQ412732）。CMV-Phy所携带的satRNA的大小为384 nt（Pz-satRNA，序列登陆号：EF363688）。CMV-Phy基因组RNA1、RNA2和RNA3与已报道其它CMV株系序列同源性结果表明：CMV-Phy RNA1和RNA2属于Subgroup IA，而RNA3为Subgroup IB。因此，CMV-Phy为重组型病毒。CMV-Phy基因组cDNA克隆在5′端添加G体外转录时有利于提高转录效率，但会降低其侵染活性。CMV-Phy基因组体外转录RNA在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子所产生的症状相一致。CMV-Phy转录产物与其它3个CMV-satRNA（Rs-satRNA，T1-satRNA和Yi-satRNA）进行假重组，结果表明：CMV-Phy除了支持自身携带Pz-satRNA在心叶烟上高含量的积累，同时也能支持其它3个CMV-satRNA在心叶烟上积累，TlsatRNA加重CMV-Phy在寄主上的症状，但其它的3个RNA减轻CMV-Phy在寄主上的症状。2．2b蛋白第55位亮氨酸决定CMV-CB7在心叶烟上系统性坏死CMV番茄株系（CMV-CB7）在心叶烟上引起系统性坏死反应。CMV-CB7基因组RNA1，RNA2和RNA3大小分别为3356 nt，3045 nt和2218 nt（序列登陆号：EF216866、DQ785470和EF216867）。CMV-CB7基因组cDNA克隆体外转录产物在心叶烟上同样产生系统性坏死症状。由CMV-CB7和CMV-Fny基因组产生假重组病毒C1C2F3，C1F2C3，F1C2C3，F1F2C3，F1C2F3以和C1F2F3以及CMV-CB7和CMV-Fny的RNA2分别构建嵌合型RNA2(RNA2^F5C3和RNA2^C3F5)在寄主上活性测定的结果表明，2b基因或3′端非编码序列决定CMV-CB7在心叶烟上产生的坏死症状。Northern杂交结果显示CMV-CB7和CMV-Fny^F3C3引起寄主植物的系统性坏死症状不是由于基因组含量比CMV-Fny和CMV-Fny^C3F5高所引起。分别将不同CMV株系的2b基因取代CMV-Fny对应部分而构建CMV-Fny突变体(CMV-Fny2b^Phy、CMV-Fny2b^Na、CMV-Fny2b^35#和CMV-Fny2b^CB7)在心叶烟上症状分析的结果表明：CMV-CB7在心叶烟上引起系统性坏死症状是由2b蛋白决定。由于CMV-CB7的2b基因同CMV-35#的2b同源性最高，因此构建2b^CB7和2b^35#6个嵌合型的2b基因。含6个嵌合型的2b基因的CMV-Fny突变体的活性分析表明：CMV-CB7的2b蛋白第52和55位的亮氨酸引起心叶烟系统性坏死症状。由于CMV的2a蛋白C端和2b蛋白的N端存在着80左右的氨基酸重叠，因此分别互补定点突变CMV-CB7和CMV-35#的2b蛋白第52位(L_CB7／F_35#)和第55位(L_CB7／P_35#)进行氨基酸互补突变，同时也对2a蛋白／2b蛋白重叠区的在第46位(F_CB7／L_35#)和第50位(T_CB7／A_35#)进行氨基酸互补突；8个CMV-Fny定点互补突变体在心叶烟症状分析的结果显示：2a蛋白／2b蛋白重叠区2a蛋白的46位（F）和第50位（T）与CMV-CB7在心叶烟上坏死表型无关；CMV-CB7在寄主上引起系统性坏死是由2b蛋白的第55位亮氨酸引起。3．决定黄瓜花叶病毒satRNA在烟草上高含量积累的位点研究通过RT-PCR分别在CMV侵染的番茄和白菜中分别获得两个satRNA（Yi-satRNA，Yn12-satRNA），Yi-satRNA分子大小为387 nt（序列登陆号DQ412733）和Yn12-satRNA分子大小为385 nt（序列登陆号：EF363688）。两个satRNA有3处碱基差异，分别为第11位（Yi-sat A，Yn12-sat U），第269位（Yi-satA，Yn12-sat U）和第367-369位（Yi-sat UAU，Yn12-satA△△）。CMV-Fny均能支持Yi-satRNA和Yn12-satRNA在烟草上高含量积累；而以CMV-CB7为辅助病毒，dsRNA检测结果显示：在烟草寄主上，Yi-satRNA高丰度积累，而无Yn12-satRNA积累。Yi-satRNA和Yn12-satRNA对CMV-CB7基因组在烟草积累量分析结果表明：CMV-CB7携带上Yi-satRNA后，其RNA1，RNA2，RNA3和RNA4大大降低，仅为单独接种CMV-CB7的RNA1，RNA2，RNA3和RNA4的12.7％，6.0％，11.1％和15.8％，而Yn12-satRNA对CMV-CB7基因组的积累量几乎无影响。因此CMV-CB7携带Yi-satRNA后其症状减轻是由于该satRNA降低了CMV-CB7的基因组积累量所引起。Yi-satRNA和Yn12-satRNA第11位、第269位和第367-369位定点互补突变结果表明：以CMV-CB7为辅助病毒，Yi-satRNA第11位A、第269位A不影响其在烟草高含量积累特性，而第367-369位UAU突变为A△△，在寄主中Northern blot检测不到Yi-satRNA分子，因此第367-369位UAU是决定Yi-satRNA高含量积累量的位点。Yn12-satRNA第11位和第367-369位突变成Yi-satRNA位点后，Yn12-satRNA均能在寄主上高含量积累。CMV-Fny与CMV-CB7的6个假重组病毒与Yn12-satRNA共同接种于烟草上，RT-PCR分析结果表明：F1C2C3、F1F2C3和F1C2F3能作为Yn12-satRNA辅助病毒，而其它3个则检测不到satRNA分子。因此Yn12-satRNA以CMV-CB7为辅助病毒不能在烟草上积累，是由其RNA1决定。由于Yn12-satRNA的5′端序列（11U）和3′端序列（367-369 A△△）突变Yi-satRNA的相应位点均可使Yn12-satRNA在寄主积累，因此以CMV-CB7辅助病毒，Yn12-satRNA不能在烟草中积累，可能是由于CMV-CB7的RNA1不能支持Yn12-satRNA所引起或者是Yn12-satRNA的复制效率很低所引起。4．黄瓜花叶病毒2b基因对其satRNA积累量的影响以CMV-Fny与Rs-satRNA共同侵染克里夫兰烟（N．clevelandii）、烟草（N．tabaccum）和本氏烟（N．benthamiana）的总RNA为模板，7 dpi和14 dpi，Realtime RT-PCR分析Rs-satRNA在3种不同烟草寄主上相对含量，结果表明：Rs-satRNA含量在烟草中最低，在本氏烟含量最高：在14 dpi，Rs-satRNA在3种寄主上含量升高，在克里夫兰烟、烟草和本氏烟寄主植株上的相对含量分别为1.54、1.08和3.51。因此以CMV-Fny作为辅助病毒，Rs-satRNA积累量在烟草寄主上的积累量跟寄主的不同品种有关。CMV-Fny、CMV-Fny2b^Phy、CMV-Fny2b^35#、CMV-Fny2b^CB7和CMV-Fny△2b与Rs-satRNA混和分别接种于克里夫兰烟、烟草和本氏烟，Rs-satRNA在不同寄主上积累量分析结果表明：CMV-Fny 2b基因缺失（CMV-Fny△2b）对Rs-satRNA在3种寄主植物上的积累量无明显影响；Rs-satRNA含量在本氏烟中含量最高，克里夫兰烟次之，而在烟草中积累量最低。CMV-Fny、CMV-Fny2b^Phy、CMV-Fny2b^35#、CMV-Fny2b^CB7在同一种寄主中，对Rs-satRNA积累量影响无明显差异，但跟烟草品种有关。因此Rs-satRNA的积累量跟寄主有关，不同CMV2b基因对Rs-satRNA含量影响无明显差异。5．SatRNA介导黄瓜花叶病毒在烟草上基因组含量降低与2b相关CMV-Fny与Rs-satRNA共同接种于烟草，Rs-satRNA能明显减轻CMV-Fny在寄主植物上症状。3、10和21 dpi，采用Realtime RT-PCR定量分析Rs-satRNA对CMV-Fny基因组积累量的影响，结果表明：Rs-satRNA明显抑制CMV-Fny基因组量的积累。3 dpi，CMV-Fny基因1a、2a、2b、3a和CP积累量分别是CMV-Fny加Rs-satRNA（CMV-Fsat）的7.6、10.8、9.8、9.7和5.8倍；10 dpi，CMV-Fny基因1a、2a、2b、3a和CP积累量分别比CMV-Fsat 1a、2a、2b、3a和CP高2.6、5.28、10.8、1.4和2.1倍；21 dpi，CMV-Fsat 1a、2a、2b、3a和CP分别为CMV-Fny 1a、2a、2b、3a和CP的62.5％、47.6％、34.5％、30.3％和52.6％。在CMV-Fny和CMV-Fsat接种寄主的新长叶中，CMV-Fny 1a、2a、2b、3a和CP分别是CMV-Fsat的1.6、24.3、37.6、3.9和7.0倍。因此，Rs-satRNA对CMV-Fny 2b基因积累量抑制效应相对明显。CMV-Fny△2b在烟草上症状明显比野生型CMV-Fny弱，接种植株仅表现轻花叶症状，与CMV-Fsat所产生的症状相似。接种CMV-Fny、CMV-Fny△2b和CMV-Fny△2b加Rs-satRNA植株中病毒基因组RNA积累量分析结果表明：CMV-Fny△2b基因组含量仅为CMV-Fny的0.5-5％，同时Rs-satRNA对CMV-Fny△2b基因组积累量无明显影响。因此CMV-Fny△2b在烟草上症状轻是由于其在寄主体内的基因组积累量低所引起；而CMV-Fny的2b基因缺失后，Rs-satRNA对辅助病毒基因组积累量没有影响。接种CMV-Fny和CMV-Fsat寄主系统叶和接种叶基因组含量分析结果表明：CMV-Fny与Rs-satRNA共同接种，其长距离运输效率明显比CMV-Fny低。CMV的2b基因主要是影响病毒的系统性侵染和抑制病毒介导的基因沉默，因此Rs-satRNA可能是由于其干扰2b基因功能，从而导致CMV-Fny在寄主体内的基因组含量降低。