论文部分内容阅读
药用植物内生真菌可产生大量结构新颖、活性独特,甚至与宿主植物相同或相似的次生代谢产物,这不仅成为寻找新型天然化合物的重要途径,而且对保护濒危的药用植物资源以及减少破坏药用植物多样性具有生态学意义。川贝母是一种川产名贵道地药材,其鳞茎为入药部位,具有良好的药效价值和多种药理活性。然而,川贝母内生真菌次生代谢产物尚未得到广泛的探索。本研究对前期课题组分离自川贝母基源植物川贝母、瓦布贝母、暗紫贝母和甘肃贝母新鲜鳞茎的18株内生真菌及其次生代谢产物的抑菌、抗氧化和美白活性进行了比较系统研究,以期为川贝母基源植物内生真菌的进一步开发利用奠定基础和提供科学依据。主要研究结果如下:（1）内生真菌拮抗活性菌株的筛选及评价通过五点对峙试验,从18株分离自川贝母基源植物内生真菌中筛选到对植物病原菌有良好拮抗作用的5株瓦布贝母内生真菌。随后,采用两点对峙法测定了5株内生真菌对23种植物病原菌的抑菌谱。发现1WBY2和3WBY3菌株显示出良好的抑菌效果以及较宽的抑菌谱,其对辣椒灰霉病菌（Sclerotinia fuckeliana）,烟草根黑病菌（Thielaviopsis basicola）,芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）水稻稻瘟病菌（Phyricularia grisea）等植物病原菌的拮抗指数均≥60%,同时,对P.grisea的9种生理小种的拮抗指数均超过50%。试验还发现,经1WBY2发酵液浸种后的水稻种子,96h发芽势显著高于清水对照,7d后的平均根长极显著高于清水对照。此外,通过水稻稻瘟病盆栽防治试验可知,1WBY2发酵原液对稻瘟病病情指数的控制效果可达66.69%,仅次于三环唑。在此基础上,通过平板对扣法发现1WBY2内生真菌挥发性成分对植物病原菌无抑制作用。对该菌株进行发酵培养,结果在供试菌保持唯一的情况下,经滤膜过滤除菌的发酵液的拮抗指数均高于高压灭菌的发酵液,1WBY2无菌发酵液对大多数植物病原菌均表现出较强抑制活性。对1WBY2菌丝和发酵液不同萃取部位进行化学成分定性分析和抑菌试验,结果发现1WBY2发酵液存在酚类等多种活性物质,其抑菌成分主要存在于乙酸乙酯萃取部位。（2）内生真菌美白活性菌株的筛选及评价通过测定18株分离自川贝母基源植物内生真菌的无菌发酵液对酪氨酸酶活性抑制率,发现WBS020、1WBY2和7WBY2三株瓦布贝母内生真菌的无菌发酵液抑制酪氨酸酶活性的能力显著高于其它菌株,其抑制率分别为79.86±0.50（%）、87.48±1.30（%）和87.31±1.05（%）,且高温处理后可保持一定稳定性。试验还发现,上述三株菌的乙酸乙酯和正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制能力显著高于其石油醚萃取物;WBS020的正丁醇萃取物,1WBY2和7WBY2的乙酸乙酯萃取物都表现较强的抑制活性。此外,在质量浓度为8mg/mL时,阳性对照维生素C的抑制能力显著强于其他萃取物,但1WBY2和7WBY2菌株乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶活性的抑制率也可达90.86±0.81（%）和88.92±7.13（%）,极显著高于其它两种萃取物。（3）内生真菌抗氧化菌株的筛选及评价采用DPPH自由基清除、ABTS自由基清除及FRAP铁离子还原能力三种方法,对课题组前期筛选抗氧化活性较好的5株瓦布贝母内生真菌单培养、两两共培养无菌发酵液进行抗氧化活性研究,再测定活性较高组合发酵液的石油醚（30-60℃）、乙酸乙酯和正丁醇提取物的抗氧化活性,以维生素C作为阳性对照。结果发现在瓦布贝母内生真菌两两共培养中,4WBY1+WBS019,6WBY3+WBS019和WBS019+WBS020三个组合无菌发酵液的抗氧化活性至少在两项抗氧化方法评价下均极显著高于单培养。试验还发现,上述三个组合的乙酸乙酯提物和正丁醇提物的抗氧化活性较强;WBS019+WBS020组合的乙酸乙酯提物在1.8mg/mL时,对DPPH自由基清除率可达74.38±0.65（%）;6WBY3+WBS019组合的正丁醇提取物(IC50=0.25mg/mL)对ABTS自由基清除作用与维生素C(IC50=0.07mg/mL)相对接近;三个组合的各提取物对Fe3+还原能力均较弱,远低于阳性对照。说明在适当条件下开展内生真菌共培养具有潜在利用价值。