【摘 要】
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戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)属于戊肝病毒科,是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,感染动物和人,引起戊型肝炎(Hepatitis E, HE)。HEV分为1、2、3、4四个基因型,其中1、
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戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)属于戊肝病毒科,是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,感染动物和人,引起戊型肝炎(Hepatitis E, HE)。HEV分为1、2、3、4四个基因型,其中1、2型只感染人,3、4感染动物和人,尤其在猪群中的阳性率非常高,猪也是HEV最主要的贮存宿主。目前已有大量有关猪HEV部分核酸序列的报道,但全基因组的报道较少,而全基因组序列分析有利于人们更好地了解HEV不同毒株之间的进化关系。鉴于此,本研究对一株HEV进行了全基因组序列分析,并制备了针对HEV ORF2编码蛋白的单克隆抗体,具体研究内容如下：1.HEV WH09株全基因组序列扩增与分析通过RT-nPCR方法,武汉市郊某猪场猪粪便中检测到一株HEV,命名为WH09株。根据报道的HEV序列设计10对PCR引物,对全基因组进行分段扩增,两末端采用RACE方法扩增,获得HEV WH09株全基因组序列。基因组全长7265bp,包含3个开放阅读框(ORF)。ORF1、ORF2和ORF3分别编码1707、674和114个氨基酸。全基因组序列比对发现,WH09株与基因4型毒株的相似度为83.0%-86.2%,与其他三型HEV为73.2%-75.2%。基于全长基因组的进化树显示,猪源HEV WH09株属于基因4型,与日本人源毒株HE-JA2处在相对独立的分支上,与其他基因4型毒株亲缘关系较远。2. HEV ORF2编码蛋白单克隆抗体的制备有研究证实戊型肝炎病毒的ORF2编码蛋白的452-617aa(命名为sORF2)含有HEV中和抗原表位,能够诱导HEV特异性中和抗体的产生,并且能够形成病毒样颗粒。本研究以带有特定酶切位点的引物扩增sORF2基因,克隆到pMD18-T载体上,酶切及测序鉴定正确后构建原核表达质粒pET28a-sORF2,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达蛋白分子量约为25kD,以可溶性蛋白存在,经Western blot检测证实所表达蛋白具有免疫学活性。将表达的蛋白纯化后以100μg/只的剂量免疫4周龄BALB/c小鼠,常规方法免疫3次后加强免疫后3天取脾细胞与SP2/0细胞进行融合。融合7天后以原核表达的sORF2蛋白包被酶标板进行筛选,经过3-5次克隆后获得9株能够稳定分泌抗HEV sORF2蛋白单克隆抗体的细胞株。
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