背景与目的恶性肿瘤是目前危及人类生命的重大疾病,由于治疗的复杂性导致各种治疗方法应运而生。肿瘤代谢重编程(包括有氧糖酵解)是肿瘤的特征之一;自噬是细胞通过溶酶体降解多余或者有害的蛋白和细胞器以达到细胞稳态和组织更新的过程,而肿瘤细胞利用这个现象抵御应激维持生存。靶向肿瘤代谢重编程和自噬是目前治疗恶性肿瘤的有效手段。二氯乙酸(Dichloroacetate,DCA)是丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂,研究发现可以通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶来抑制有氧糖酵解而达到抗肿瘤代谢的目的。在我国,二氯乙酸二异丙胺(Diisopropylamine dichloroacetate,DADA)是临床常用的保肝药,由 DCA和二异丙胺(Diisopropylamine,DIA)合成。本研究探讨DADA在抗肿瘤中的作用,并将DADA与DCA抑制肿瘤的作用进行了系统的对比研究。同时,我们还首次发现,DADA能够阻断细胞的自噬潮导致不完整自噬的形成,揭示了其有效的抗肿瘤的机制,为临床使用DADA治疗恶性肿瘤提供了理论依据,有望实施临床转化。材料与方法1.抑制细胞增殖的检测:1)选择人肝癌细胞株97H、7402和LM3,人胆管癌细胞株QBC939,人胰腺癌细胞株PANC-1,人胃癌细胞株SGC-7901及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231予以不同浓度梯度的DADA及DCA干预后48h MTT实验检测细胞活力计算抑制率;2)选择MCF-7和MDA-MB-231细胞株予以不同浓度梯度的DADA及DCA干预后48h MTT实验检测细胞活力计算IC50。2.体内肿瘤抑制作用的检测:6～8周龄的雌性BALB/c裸鼠,每只裸鼠注射5 X106个MDA-MB-231细胞于右侧背部,观察肿瘤生长,一周后测量肿瘤体积达到100～150mm3时分组处理。1)分对照组、DADA低剂量组(15 mg/kg)和DADA高剂量组(100mg/kg),每日灌胃,测量肿瘤大小,建立生长曲线;2)分对照组、DADA组(100 mg/kg)和DCA组(100 mg/kg),测量肿瘤大小,建立生长曲线。3.自噬相关蛋白表达的检测:1)DADA及DCA分别按照时间梯度和浓度梯度干预MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞,24h和48h后收取细胞Western blot分析细胞内的p62和LC3的表达;2)MDA-MB-231细胞加入DADA和CQ、BEZ235干预24小时后收取细胞Western blot分析细胞内的p62和LC3的表达。4.抗肿瘤代谢的检测:MDA-MB-231细胞分别予以DADA及DCA时间梯度和浓度梯度干预,按拟定的时间收取上清液,应用乳酸测定和葡萄糖测定试剂盒测定乳酸产生的量和葡萄糖的消耗量,建立曲线。5.自噬囊泡的检测:1)将质粒GFP-LC3转染细胞24h后加入DADA,培养24h后进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察点状绿色荧光的LC3的分布;2)MCF-7细胞加入DADA干预,培养24h后收取细胞,固定后透射电镜下观察细胞内的超微结构——双层膜囊泡。结果1.DADA在体外能抑制多种恶性肿瘤细胞株的增殖,在体内实验中100mg/kg的剂量能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。DADA与DCA对比,两者都可以抑制肿瘤细胞增殖和体内肿瘤的生长,但DADA的作用明显强于DCA,病理切片免疫组化检测Ki67也发现DADA组的Ki67的表达低于DCA组。2.DADA较DCA更能有效的抑制肿瘤细胞增殖及抑制肿瘤生长潜在的机制:在抗肿瘤代谢方面,DADA更能有效的抑制肿瘤细胞乳酸的生成及抑制肿瘤细胞对于葡萄糖的摄取,干扰了肿瘤代谢;另一方面,DADA和DCA都诱导了自噬,但DADA诱导晚期不完全性的自噬,导致细胞自噬性死亡。3.DADA处理的肿瘤细胞形态学观察可见大量细胞内空泡的产生,而对正常细胞没有类似作用;含空泡的肿瘤细胞Western blot分析提示LC3表达升高,而免疫荧光共聚焦显微镜观察发现肿瘤细胞内空泡表面有点状的GFP-LC3绿色荧光的分布,透射电镜观察细胞内超微结构发现空泡为双层膜结构的囊泡。4.DADA阻断自噬潮诱导不完全性自噬:1)自噬受体蛋白SQSTM1/p62及脂化的LC3在DADA处理后的晚期(24h)都升高,提示了自噬潮的阻断;2)通过RFP-p62质粒的转染共聚焦显微镜下观察到了晚期SQSTM1/p62的累积而不是和自噬溶酶体一起降解;3)DADA的组成成分DIA与DCA联合处理细胞与DADA一样能诱导大量自噬,而DCA单用未见大量自噬的产生。结论1.DADA具有明确的体外抑制肿瘤细胞增殖和体内抑制肿瘤生长的作用,与DCA相比,两者都有抑制肿瘤细胞增殖的作用,但DADA更显著。2.DADA较DCA更能有效的抑制乳酸生成和抑制葡萄糖摄取,能诱导更多的不完全性自噬,解释了 DADA抑制肿瘤作用优于DCA的原因。3.DADA能诱导肿瘤细胞产生大量的空泡,证实为自噬性空泡。DADA抑制肿瘤作用的潜在机制是阻断了细胞的自噬潮导致了不完全自噬的形成,而这个作用要归功于DIA的参与。