【摘 要】
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加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)AF1是课题组自主分离的菌株,前期研究结果表明:该菌株代谢物对革兰氏阳性菌具有良好的杀菌和抗菌活性,但对革兰氏阴性菌不敏感,对耐甲氧
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加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)AF1是课题组自主分离的菌株,前期研究结果表明:该菌株代谢物对革兰氏阳性菌具有良好的杀菌和抗菌活性,但对革兰氏阴性菌不敏感,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),其最小抑菌质量浓度(MIC)为68μg/mL;同时具有一定的抗真菌活性,0.3mg/mL的发酵液提取物对香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)抑菌率达94.1%;能导致金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌静息细胞的细胞壁破裂,具有明显的杀菌活性,与现有抗生素的作用机理相比,具有明显的新颖性。本文在课题组前期对AF1抗菌代谢物在菌体内的分布和培养基初步优化的基础上,研究接种方式、表面活性剂对AF1菌株生长和抗菌生物活性物质代谢及其分布的影响,以期提高加利利链霉菌AF1的发酵效率;并对AF1菌株代谢产物的分离进行了初步研究。菌丝体形态特征观察、发酵液中的总糖和还原糖量的动态变化、发酵液pH值的动态变化、以及其发酵液中抑菌活性物质积累的研究结果表明:孢子、孢子·菌丝和菌丝三种接种方式对加利利链霉菌AF1发酵过程的影响不同,不同接种方式导致菌体形态、总糖含量、还原糖、发酵液pH值和抑菌圈直径均存在差异,其中孢子接种的菌丝球细小致密、表面较光滑、生长周期同步,虽然生长延迟期较长,但是其对淀粉的利用更充分。孢子接种量为5×106个/100mL时,抑菌圈直径是菌丝接种的1.17倍,表明采用孢子接种更利于发酵生产抗生素。添加表面活性的单因素试验优化结果表明,吐温-80、曲拉通X-100、山梨醇等表面活性剂能提高发酵液中抗菌活性物质积累量,最佳添加时间为接种后120h。采用Box-Behnken试验设计和响应面分析对表面活性剂添加浓度进行优化,得出以加利利链霉菌AF1发酵液抑菌圈直径为响应值(Y)的回归方程:Y=19.07+0.94X1+0.52X2-0.49X3+1.15X1X2+0.17X1X3+0.56X2X3-2.56X12-2.83X22-3.03X32,推导出表面活性剂的最优添加条件为:吐温-80:8.85g/L、曲拉通X-100:2.14 g/L、山梨醇:3.84g/L。三种表面活性剂组合优化后,发酵液抗菌活性提高了25.45%,采用流式细胞仪测定法观察了添加表面活性对AF1细胞膜通透性的影响,结果表明:添加表面活性剂可以极显著增加细胞膜通透性,导致胞内活性物质的外排量增加,进而提高了抑菌活性物质的生物合成量。采用正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和薄层层析制备等方法对加利利链霉菌AF1菌株的发酵液粗提物进行了分离纯化,得到了一个化合物,经过核磁共振分析确定其为蒽醌类化合物4-脱氧-ε-吡咯霉酮。
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