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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)是一个影响养牛业经济发展的重要病原,它能够引发牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhoea,BVD)。BVD是急性和繁殖障碍型传染病,使牛发生病毒性腹泻、发热、黏膜溃疡和白细胞数量减少等症状。发达国家通过检测和隔离PI牛控制BVD,我国河南、山东和新疆等地区BVD的发病基因型不同,以BVDV-1型为主要流行基因型,早发现早诊断早治疗是防控该病的关键。本研究以BVDV为研究对象,对其E2基因进行克隆表达、纯化,鉴定其反应原性,并建立BVDV间接ELISA检测方法。1、BVDV E2基因编码蛋白的原核表达与纯化采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体p ET28a连接,构建重组表达质粒p ET28a-E2,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,可溶性表达在天然条件下纯化,用不同浓度咪唑洗除杂蛋白。经纯化后的蛋白Western blot分析鉴定反应原性。结果表明:成功构建了p ET28a-E2重组质粒,并在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为42 KDa,纯化后的蛋白浓度16.7μg/m L,且能被BVDV阳性血清识别,具有很好的反应原性。结论:E2基因蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了实验基础。2、BVDV E2基因的间接ELISA方法的建立与初步应用本试验通过确定最佳稀释度的血清来检测的抗原的最佳浓度,同时通过确定最佳封闭液和封闭时间,酶标二抗工作浓度和工作时间以及最佳底物作用时间,来计算出阴阳临界值,并进行特异性和敏感性以及重复性试验来检测建立ELISA方法的效果。结果表明:在1:32倍抗原稀释度和1:100倍待检血清稀释度下,5%脱脂乳封闭90 min,在酶标二抗1:3200倍稀释时,作用60 min,底物作用10 min,P/N值最大,阴性临界值0.259,大于临界值为阳性与商品化试剂盒的总符合率为90.9%,初步建立了BVDV E2基因的间接ELISA方法。应用后确认,建立的间接ELISA方法具有更好的特异性和灵敏度。