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猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE),简称乙脑,是由猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的常见病毒性脑炎,对人的致死率高,约为25---40%,对猪的致死率不高,但引起造成怀孕母猪发生繁殖障碍是主要的经济损失,对作为畜牧业支柱产业的养猪业持续增产造成巨大的危害。近年来,乙脑的传染范围不断扩大,严重威胁公共安全和养殖业。而抗乙脑病毒的中和性单抗能够有效地降低病毒的致病能力,且具有较高的特异性和生物学活性,在病毒的诊断检测和治疗预防中有着良好的应用前景。本文用常规的杂交瘤制备技术获得了抗乙脑病毒(NJ2008株,GQ918133,以下实验中所用的乙脑病毒均为此株)的7株单抗,用BHK-21细胞培养后冻于-20℃,反复冻融三次后经蔗糖密度梯度离心,将所获纯化病毒免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA法进行筛选,抗原即为免疫原,加强免疫时用EDHI,筛选时分别用EDIII和纯化的乙脑病毒筛选。最后获得七株能稳定分泌的杂交瘤细胞,分别命名为1H5F9、2D7E4、2B4B4、1H4、2E3、2B4、4D4,然后用常规方法免疫小鼠制备腹水,并测亚型后用Protein A纯化柱纯化。用ELISA、Western Blot、IFA、流式细胞术以及中和实验等方法鉴定7株单抗的生物学特性。结果显示1H5F9、2D7E4、2B4B4能识别BHK-21细胞的蛋白,1H4和2B4只识别EDⅢ而2E3和4D4两种都能识别,因此1H5F9、2D7E4、2B4B4由于只识别细胞而淘汰,2E3和4D4则在后续的实验作为对照。中和试验结果显示4株单抗都有一定的中和活性,且结果为：2B4>1H4～4D4>2E3。临床实例应用进一步证明用特异性和反应性最高的2B4能够检测出感染JEV的小鼠的脑脊液中JEV的存在及水平。根据单抗特性鉴定的结果,1H4和2B4能与JEV的EDⅢ和MEP都反应,且Western Blot显示表位是在同一个蛋白上,因此推断这2株单抗的识别位点是在EDⅢ和MEP共有序列上的。同时,本文用M13噬菌体展示肽库筛选单抗的表位,以进一步验证上述推断。MegAlign和Blast的结果显示,"HH-H"(E394-E397)是最有可能的结合位点。在此基础上,合成EDⅢ和MEP共有序列多肽,P1:TVN PFV A (E356-E362)和P2：EME PPF GDS YIV VGR GDK QIN HHW HKA (E373-E399)以及含噬菌体筛选出的位点的短肽NHH WHK A (E394-E398),用ELISA进一步验证,发现1H4与3条肽都反应,而2B4则只与P3反应,并且用P3作为抗原能够检测猪的乙脑阳性血清,说明E394HHE398有效诱导产生抗体,且E396-M很可能是决定中和活性的一个关键位点。空间构象和理化分析显示该位点在p折叠的末端,且B94HHWHE398富含亲水氨基酸,能够作为表位诱导机体免疫反应。因此,该位点对乙脑的进一步研究有着重要的意义,单抗1H4和2B4也有望应用于建立相应的检测方法和疫苗。