【摘 要】
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肌内脂肪（Intramuscular Fat,IMF）在猪肉品质性状中起着关键作用,肌内脂肪含量的累积主要取决于肌内脂肪细胞的数量和大小,而脂肪细胞的生成是一个受到以转录因子为核心的转录级联网络调控的过程。转录因子HMG20A（HMG domain protein 20A,HMG20A）是高迁移率家族的成员,研究已证实HMG20A在神经元分化、上皮间质转化以及Ⅱ型糖尿病发生过程中发挥着重要的调控作
【基金项目】
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山西省应用基础研究面上青年项目（201901D211369）； 国家自然科学基金（31872336）； 三晋学者支持计划专项经费资助（2016,2017）；
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肌内脂肪（Intramuscular Fat,IMF）在猪肉品质性状中起着关键作用,肌内脂肪含量的累积主要取决于肌内脂肪细胞的数量和大小,而脂肪细胞的生成是一个受到以转录因子为核心的转录级联网络调控的过程。转录因子HMG20A（HMG domain protein 20A,HMG20A）是高迁移率家族的成员,研究已证实HMG20A在神经元分化、上皮间质转化以及Ⅱ型糖尿病发生过程中发挥着重要的调控作用,而本试验利用前期研究数据发现,HMG20A在猪肌内前体脂肪细胞成脂分化早期表达量显著升高,可能是调控脂肪生成的关键因子,但其调控机制尚不明确。因此,本研究通过PCR扩增获得猪HMG20A基因的CDS区,并对其进行生物学特性分析;随后通过基因功能“缺失”和“获得”研究HMG20A对成脂分化的影响;利用转录组测序寻找HMG20A的下游靶基因进而揭示下游调控机制。后通过lncRNA测序结合干扰HMG20A试验结果,筛选HMG20A的下游lncRNA,并对其调控成脂分化的功能进行研究。研究结果如下:1、HMG20A在马身猪肌肉组织中的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）,且在分化早期显著升高。通过PCR技术成功获得了猪HMG20A基因的CDS区,全长1044 bp,编码347个氨基酸,该基因及其所编码的蛋白在不同物种中高度保守。在猪肌内前体脂肪细胞中干扰HMG20A并诱导分化7 d后,油红O染色发现成熟的脂滴明显增多,q RTPCR结果显示CEBPα、PPARγ和FABP4的mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）,表明HMG20A有抑制猪肌内前体脂肪细胞成脂分化的能力。随后,在小鼠上的功能进行了验证,在C3H10T1/2细胞中干扰HMG20A并进行诱导分化后,结果显示脂滴显著增多,成脂关键基因CEBPα、LPL和FABP4的mRNA表达量显著升高（P＜0.05）,FABP4蛋白的表达极显著升高（P＜0.01）,表明干扰HMG20A促进C3H10T1/2细胞的成脂分化;过表达HMG20A后则抑制C3H10T1/2细胞的成脂分化,说明HMG20A物种功能的保守性较高。2、为了揭示HMG20A的下游调控机制,通过转录组测序和比较分析,干扰HMG20A组与对照组相比,有271个显著差异基因,其中上调基因171个,下调基因100个。GO和KEGG结果显示,差异基因主要富集在MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等。通过体外干扰、过表达试验以及h TFtarget数据库预测证明了差异表达基因MEF2C为HMG20A的潜在靶基因。利用Co IP技术发现HMG20A和LSD1存在蛋白互作关系,CHIP-q PCR结果显示干扰HMG20A后降低了MEF2C启动子区域的H3K4me2修饰（P＜0.01）和mRNA表达（P＜0.05）。同时干扰LSD1后,缓解了HMG20A对MEF2C的促进作用并抑制了成脂分化。3、为研究HMG20A与表观遗传调控分子lncRNA之间是否存在调控关系,试验通过比较分析1日龄马身猪与大白猪背最长肌中差异表达的lncRNA,随后在干扰HMG20A后发现差异表达的lncRNA-6617的表达量极显著下调（P＜0.01）。生物信息学分析发现lncRNA-6617位于猪18号染色体上,无蛋白编码能力。核质分离结果显示,lncRNA-6617主要分布于细胞核。q RT-PCR结果显示其在各个组织中均有表达,且在猪肌内前体脂肪细胞的分化过程中表达量呈上升趋势。在猪肌内前体脂肪细胞中干扰lncRNA-6617并进行诱导分化后,油红O染色发现分化的成熟脂肪细胞显著减少,q RTPCR结果显示CEBPα、PPARγ和FABP4的表达均极显著下调（P＜0.01）,表明干扰lncRNA-6617抑制猪肌内前体脂肪细胞成脂分化。综上所述,本研究发现HMG20A是调控脂肪细胞生成的负调控因子。HMG20A通过与LSD1互作调控下游靶基因MEF2C的组蛋白修饰,进而调控脂肪细胞生成。同时,本研究发现HMG20A还可通过改变lncRNA-6617的表达调控猪肌内脂肪细胞成脂分化。本研究初步探究了HMG20A调控肌内脂肪生成的作用及机制,丰富了肌内脂肪生成调控网络。
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