ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种由25-35个L-赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基之间的酰胺键连接而成的同聚物。它可被生物降解、易溶于水、对热稳定,并拥有广泛的抑菌谱,包括酵母、真菌、革兰氏阳性和阴性细菌,甚至具有抗噬菌体的活性。而且,ε-PL具有很高的安全性。因此,它被当做一种天然的食品防腐剂在很多国家(日本、韩国、美国以及中国)被广泛使用。本论文以一株ε-PL高产菌Streptomyces albulus M-Z18(S.albulus M-Z18)为研究对象,通过人工神经网络(ANN)优化方法,构建了一种基于农工业副产物为有机氮源的廉价高效培养基;利用微生物生理学和RNA-测序(RNA-Seq)技术,研究其酸性p H响应机制;基于此,借助环境胁迫手段,建立了一种具有工业化应用潜力的酸性p H冲击发酵策略,并考察了酸性p H冲击在补料-分批发酵过程中引起的生理变化。具体研究结果如下:1)农工业副产物鱼粉和玉米浆作为廉价的替代有机氮源被用于ε-PL的工业化生产。随后,通过ANN在摇瓶发酵中优化得到一种最佳的营养配比;氨基酸分析表明:优化培养基中富含谷氨酸、精氨酸、赖氨酸以及天冬氨酸,这不仅能够提高菌体对酸的耐受能力,而且能够促进菌体生长和ε-PL的合成。因此,在5 L发酵罐中经过176h的补料-分批发酵,ε-PL的产量和产率分别达到35.24 g·L-1和4.85 g·L-1·d-1,相比于原始配方分别提高了17.0%和15.1%。2)从细胞壁、细胞膜以及胞内微环境水平研究S.albulus M-Z18的酸性p H生理响应机制。扫描电镜分析发现,细胞壁在不同的环境p H条件下(5.0,4.0,3.0)均保持完整性,且p H 4.0时菌丝表面的囊泡状凸起可能与ε-PL的合成或分泌相关。细胞膜在酸性p H条件下仍保持正常的选择通透性,以减少胞内物质的泄露并阻止胞外有毒物质的流入;对细胞膜脂肪酸组成的研究表明,酸性p H能够引起脂肪酸不饱和度增加以及碳链长度降低,从而导致细胞膜的流动性增加,并伴随着细胞膜稳定性降低。同时,在酸性p H条件下,细胞能够通过提高胞内H+-ATPase活力、ATP以及氨基酸浓度(精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸)的方式将胞内p H(p H i)稳定在7.7左右。此外,细胞对酸性p H的生理响应也有利于ε-PL的合成。3)通过RNA-测序技术比较S.albulus M-Z18在不同p H条件下(5.0,4.0,3.0)的全局基因转录水平的差异,进而从转录水平揭示其酸性p H响应机制。酸性p H能够引起细胞的全局性响应;一些与转录调控、胁迫响应蛋白、转运蛋白、细胞壁和细胞膜、次级代谢产物合成、DNA和RNA以及核糖体相关的基因在酸性p H的响应中发挥重要的作用。最终,基于生理和转录水平的研究,初步阐明其酸性p H响应机制,并推测合成ε-PL也是S.albulus M-Z18响应酸性p H的一种方式。4)环境胁迫是一种促进链霉菌中次级代谢产物合成非常重要的方法。本章在5 L发酵罐中考察酸性p H冲击对S.albulus M-Z18合成ε-PL的影响。基于酸性p H对菌体代谢活力影响的评估以及冲击相关参数的优化,建立一种集成的酸性p H冲击策略:首先,在p H 5.0条件下进行酸性冲击前预适应以减轻由随后的p H冲击阶段造成的损伤;随后,在p H 3.0条件下冲击12 h(包括p H自发从4.0降为3.0的时间)以调控菌体的代谢活力;最后,将p H提高到4.0为ε-PL合成提供最适条件。经过192 h的补料-分批发酵,ε-PL的最高产量和产率分别达到54.70 g·L-1和6.84 g·L-1·d-1,与未经过p H冲击的发酵相比提高了52.50%。研究表明,酸性p H冲击是一种促进ε-PL合成非常有效的方法。5)采用酸性p H冲击成功地解决了ε-PL补料-分批发酵中存在的共性缺陷,即补料阶段的ε-PL产率快速下降现象。为了揭示其中的潜在机制,我们比较了p H冲击(PS)和p H不冲击(PNS)补料-分批发酵合成ε-PL过程中S.albulus M-Z18的生理变化。形态观察表明,菌球形状在这两个发酵过程中都保持不变;此外,PS中菌球大小的分布几乎不变,而PNS中的菌球大小和数量则随着时间的变化而逐渐减少。这种现象也与两种策略中ε-PL产率的变化一致,因此菌体形态可以用于监测补料-分批发酵中ε-PL的产率变化。在PS中,p H冲击后发生二次生长现象,并伴随着活菌丝体在菌球内部的重新出现;与此同时,菌体的呼吸活力以及中心代谢途径和ε-PL合成途径的关键酶活全部被强化,且一直持续到补料-分批发酵的终点。因此,由酸性p H冲击导致的菌体生理变化协同并持久地促进了ε-PL产率的提高。然而,在PNS中则未发生二次生长以及活菌丝体重新出现的现象。本研究表明,短期的菌体生理代谢抑制能够确保长期的ε-PL产率提高。