冬虫夏草是子囊菌门冬虫夏草菌[Ophiocordyceps sinensis (Berk.) Sung et al.]寄生在蝙蝠蛾科幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草作为名贵滋补中药材,具有“补肾益肺,止血化痰”之功效,主要分布于青藏高原海拔3,000-5,000m的高寒草甸中,中国占总产量的90%以上,不丹、尼泊尔有少量分布。冬虫夏草野生资源过度采挖导致自然生境严重破坏,进一步加剧了其濒危状态,已被列入《国家重点保护野生植物名录》。因自然储量急剧下降,而人工大规模培育尚未成功,冬虫夏草市场供需矛盾日益突出,其生物学保护工作迫在眉睫。本文采用现代科学技术,包括遥感、地理信息系统、DNA条形码技术、高通量测序等对冬虫夏草的生态环境、混伪品鉴定及子实体转录组进行了系统研究,并建立了冬虫夏草的人工培育体系,为冬虫夏草资源可持续利用及生物多样性保护奠定了基础。本文采用遥感(RS)技术和中药材产地适宜性分析地理信息系统(TCMGIS)对冬虫夏草分布区域的植被和生态因子值进行了分析。对1981～2010年间的植被覆盖度变化趋势分析发现,四个主产县市无植被覆盖区域面积显著增加,高植被覆盖区域面积显著降低,表明冬虫夏草产地的生态环境已经发生了明显改变,生态可用性正在降低。利用TCMGIS系统对冬虫夏草5个省区15个县市23个乡(镇)的164个样点的生态因子值进行了分析,得出了冬虫夏草最适生态因子值范围,其中年均气温4.3～16.9℃；1月均温-16.9～2.6℃；7月均温5.0～17.0℃；年均日照时数1,666～2,943 h；年均降水量363～922mm;年均相对湿度52.6%～71.9%。根据生态因子值范围,预测到95%～100%生态相似度的区域共有726,917.7 km2,主要分布于西藏、四川、青海、甘肃、云南等省(区)的205个县(市)。该区域为冬虫夏草人工培育或野生抚育基地的选择等提供可靠的依据。人工培育是缓解市场供需矛盾最主要的方法之一。在生态因子值分析的基础上,我们选择四川省康定县作为冬虫夏草人工培育基地。通过研究,筛选出优良寄主“小金蝠蛾”,将冬虫夏草和寄主“小金蝠蛾”生长周期从野外的4-5年缩短为1年,并育出天然冬虫夏草3,035根。小金蝠蛾幼虫具有生长速度快,抗病能力强等特征。人工培育成虫繁殖能力强,在形态、羽化、交配、产卵等行为上与野生相似,人工培育小金蝠蛾的种群世代增长率第一代达到了177.27%,第二代117.56%。表明人工条件下能达到种群的持续利用。冬虫夏草资源的濒危推高其市场价值,目前价格超过了黄金,市场出现了大量人造混伪品。为验证DNA条形码对冬虫夏草及其混伪品鉴定的准确性,对53份冬虫夏草样品及7种常见混伪品的ITS序列进行了扩增,并从GenBank中下载了87条发表的冬虫夏草和7个近缘物种的ITS序列。结果表明,53个冬虫夏草样品的ITS序列都能被成功扩增,18条冬虫夏草及其混伪品新增的单倍型序列已提交GenBank数据库。采用BLAST1和Nearest genetic distance法对冬虫夏草及其混伪品的鉴定效率均为100%;在MP树、NJ树和ML树中,冬虫夏草的所有单倍型序列都聚在同一支上。因此,DNA条形码技术能准确、快速、精确地鉴定冬虫夏草及其常见的混伪品及近缘种。为研究冬虫夏草子实体发育及次生代谢产物的合成途径,采用Roche 454局通量测序技术对冬虫夏草子实体进行了转录组测序。共得到34,289条独立基因,包括17,059叠连群和17,230单一序列。基于GO和KEGG分析,得到冬虫夏草子实体发育阶段的基因表达谱。通过分析发现了大部分参与子实体发育的相关基因,包括MAT交配型基因、信号传导途径、转录因子等。首次发现冬虫夏草的MAT1-1由3个基因组成,分别为MAT1-1-1, MAT1-1-2和MAT1-1-3。另外,还发现了所有参与PKA和MAPK信号传导途径和大量转录因子,如C2H2型锌指蛋白、Zn2Cys6型锌指蛋白、碱性亮氨酸拉链bZIP等。重要的是,发现了全部虫草素生物合成推测路径中酶的相关基因,其中最重要的核苷酸还原酶(RNRs)的大、小亚基有4个转录本。通过SSR分析搜索到1255个SSR位点,其中三核苷酸的位点最多(58.65%),为发掘新的分子标记提供了依据。本研究对冬虫夏草的生态环境、人工培育、混伪品鉴定及子实体的转录组信息进行了研究,为冬虫夏草的生态环境保护、人工培育、市场监控等提供了科学参考和理论依据,并为研究冬虫夏草的生物学特性、基因功能等提供了丰富的基因资源,将进一步推动冬虫夏草保护生物学的深入研究,最终实现冬虫夏草资源的保护和可持续利用。