1研究背景仿制药是与原研药在药动学和药效学均等效的药物。仿制药与原研药含有相同的活性成分、剂型、给药方式,且纯度、质量标准、说明书均基本一致。另一方面,生物等效药物以相似的释放速率释放活性成分,在作用部位疗效相当。药动学参数常用于评价两药是否等效,采用药时曲线下面积(Area under the plasma concentration-time curve, AUC)和最大血药浓度(Maximum plasma concentration, Cmax)反映药物吸收的程度,达峰时间(Peak time,Tmax)评价药物的吸收速率。生物等效性评价是仿制药审评的关键环节,主要以AUC和Cmax应在原研药90%可信限在80%-125%置信区间内。若仿制药的活性成分在作用部位以相似的释放速率释放,则认为它们具有相似的安全性和有效性。仿制药应与原研药具有相似的药理活性而不产生预期之外的临床作用和不良反应。目前,全世界约30%人群不能获得基本药物,而在非洲这个比例更高,达500%o～60%。药物的高价格成为基本药物供给的一个重要限制原因。在有些发达国家由于政府的补助,人们可以免费或以低价格获得一些基本药物,但对于一些慢性疾病如高血压、糖尿病、哮喘等,药物的临床应用仍受价格影响。为减少公众药物的开支,增强公众对基本药物的购买力,许多国家批准仿制药上市。1984年美国通过Hatch-Waxman法案,该法案允许仿制药通过生物等效性实验后可上市,之后许多国家也采用了此法用于仿制药的审批。除生物等效性试验之外,仿制药无需进行临床前和临床实验(除特殊情况),故在价格方面常比原研药更具优势。近二十年来,仿制药的使用已证明是减少药品支出和增加基本药物覆盖率的方法之一。2008年美国65%以上处方使用仿制药,占当年药品总费用的20%；且2011年该比例已上升至80%。仿制药的普及和使用不仅仅存在于发达国家,大多数的低收入和中等收入国家几乎全部采购和使用仿制药。仿制药的使用不仅可降低药品支出,同时也是平衡疗效和患者医疗资源的一种手段。在相当长的一段时间内,仿制药的安全性和有效性一直饱受消费者、医药卫生人员和制药企业的争议。有的甚至质疑原研药的审批程序是否能保证药物的安全性和有效性。医药卫生人员和患者认同原研药比仿制药更安全有效,有报道在使用仿制药时发生其他的不良反应,故医生和患者在治疗特殊疾病时会选用原研药而非仿制药,如抗精神病的药物和治疗窗窄的药物。这类药物在更换品牌时可能会由于浓度的改变发生中毒症状或疾病不能控制的状况。这引起了FDA的重视,FDA对上市后的224个仿制药进行再评价,发现仿制药的生物利用度与原研药存在平均为3.5%的偏差,仿制药的质量和安全性均不如原研药好。仿制药与原研药有效活性成分相同,但所用的赋形剂不同。这些赋形剂为非活性成分,主要用于改善药物性能、简化制剂工艺,提高制剂的质量和稳定性。但赋形剂的种类和数量可对药物疗效产生一定的影响,可通过改变药物的性能如硬度、崩解时限和溶解度,从而影响药物生物利用度。Smith等研究来自19个国家20家制药企业生产的卡维地洛制剂,发现仿制制剂存在片剂硬度不符合要求、溶出量不足和杂质含量过多等问题。卡维地洛仿制药所示的这些质量问题势必会影响该药物制剂的药效和耐受性。一般专利药到期后,原研公司并未透露其制剂处方和制备工艺。这意味着,仿制药公司和原研药公司可能会使用不同的制备工艺生产相同的药品,从而影响药品的质量和纯度。质量较差的药品可能对社会产生严重的危害,甚至可导致耐药性菌株的发展。活性成分少及溶出度差的药品将无法治愈疾病,过多的活性成分和杂质也将对病人造成不良影响。由于选择仿制药的动机是降低医疗成本,但如果使用的是质量低劣的仿制药其医疗成本可能更高。由于市场的驱动力以及药品监管力度不够导致大量的低质量药物流向市场,因此,为确保临床所用药物质量的合格性,对所有药物尤其是仿制药上市后的再评价显得尤为重要。替米沙坦是一种强效的选择性血管紧张素Ⅱ受体(Angiotensin Ⅱ receptor type Ⅰ, AT1)抑制剂,用于原发性高血压和有心血管危险而不能接受血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)治疗的患者。替米沙坦对收缩压和舒张压均有降低效果,除降压效果较好外,不良反应和耐受性较ACEI口其他AT1抑制剂少。替米沙坦在糖尿病患者中有肾脏保护作用,提高患者生活质量。替米沙坦具有亲酯性,在水中几乎不溶,且易解离,在不同pH水性介质中溶解性差异明显。在pH3～9的水性介质中几乎不溶,在低、高pH溶液中溶解度增大。替米沙坦具有多晶型,分别为A、B、C晶型。替米沙坦属于生物药剂学分类Ⅱ类药物,溶出是影响其生物利用度的限速步骤。2目的从片剂的含量、有关物质及在四个不同的pH值溶出介质(分别为1.2、4.5、7.5和水)中的溶解度和溶出曲线比较了市售的10个替米沙坦仿制制剂与原研制剂美卡素(?)的质量差异。3方法3.1替米沙坦分析方法的建立及验证采用HPLC法测定溶液中的替米沙坦含量。3.1.1色谱条件固定相：Agela C18柱(5μm,4.6×150mm)；流动相：甲醇：50mM磷酸二氢铵=65：35,磷酸调节pH为3.0；流速：1mL·min-1；柱温：40℃检测波长：298nm；进样量：20μL。3.1.2线性关系考察配制浓度为0.04、0.064、0.08、0.096、0.16mg·mL-1的替米沙坦标准溶液,分别取上述标准溶液20μL注入色谱仪测定。以替米沙坦峰面积为横坐标(X),替米沙坦浓度为纵坐标(Y)进行线性回归,求得回归方程。3.1.3重复性试验配制浓度为0.08mg·mL-1的标准替米沙坦溶液6份,进样分析。3.1.4回收率试验通过添加80%、100%、120%的替米沙坦到预处理的替米沙坦溶液中,混合均匀后进样分析。每个样品平行操作3份。3.2含量测定取20片替米沙坦片称重,计算平均片重,粉碎研磨。称量相当于8mg替米沙坦的粉末置于100mL容量瓶中,加入约70mL的稀释剂(0.005mo1·L-1NaOH溶液)后超声5min至完全溶解,静置后用稀释剂定容至刻度。取部分溶液用0.22μm过滤器滤过,采用HPLC法测定续滤液中替米沙坦含量。3.3溶解度测定称量相当于20mg替米沙坦的粉末溶解于1mL不同pH值溶出介质(分别为1.2、4.5、7.5和水)中,充分混匀,将制得的混悬液37℃放置48h。离心后取上层液用0.22μm滤膜过滤,采用HPLC法测定续滤液中替米沙坦含量。3.4有关物质测定称量相当于8mg替米沙坦的粉末溶解于8mL稀释剂(0.005mol·L-1NaOH溶液)中,充分混匀,取上清液用0.22μm滤膜过滤,续滤液采用HPLC法测定分析。对于续滤液浓度过高样品,先将续滤液稀释1000倍后进样分析。采用面积归一化法计算有关物质的百分比含量。3.5溶出度研究按照中国药典2010版规定的溶出度测定法第Ⅱ法(桨法),取替米沙坦片6片,分别投入温度37℃±0.5℃、转速75r/min的900mL脱气介质中,分别于5、10、15、20、30min取样10mL,同时补充37℃士0.5℃新鲜介质10mL,样品立即采用0.22μmm微孔滤膜过滤,自取样至滤过应在30s内完成。取续滤液在相应波长处测定A值,计算溶出介质中药物浓度,计算各时间点的累积溶出百分率,绘制溶出曲线。4结果4.1含量测定替米沙坦测定的HPLC法,在0.04～0.16mg·mL-1浓度范围内线性关系良好,重复性、回收率均满足体外样品定量测定要求。USP规定替米沙坦的平均含量为标示量的95%～110%,本研究所选替米沙坦片剂平均含量均符合要求。4.2溶解度测定原研制剂和Generic1、4和7的替米沙坦在水和pH7.5介质中溶解性很好,Generic3在这两种介质中溶解度也较高。原研制剂和仿制制剂在pH1.2的介质中溶出稍好,而pH4.5介质中溶解度均较差。4.3有关物质的测定Generic1在本实验条件含有最多种类的有关物质,其次是Generic9,5和4,Generic2、3和6含有关物质的种类最少。USP规定替米沙坦片中单个杂质含量不应超过0.2%,依据此标准Generic8有2个杂质超标,Generic4、9和10各有一个杂质超标。原研制剂在所有制剂中总杂质含量最少,其次是Generic2和6。而Generic9杂质总含量最多,其次是Generic8和10。4.4溶出度4.4.1测定波长的选择采用不同pH值介质(分别为1.2、4.5、7.5和水)配制替米沙坦标准溶液,在200～400nm波长范围内进行紫外扫描。选择最大吸收波长为测定波长。结果显示pHHl.2、pH4.5、水和pH7.5介质中的检测波长分别为291nnm、297nm、296nm和296nm。4.4.2在pH7.5溶出介质中的溶出曲线4个仿制制剂在此介质中溶出差,60min内替米沙坦累积溶出量小于20%,远低于USP规定的片剂溶出度要求。其余7个仿制制剂溶出效果好,在30min内的累积溶出量均达到80%以上。4.4.3在水中的溶出曲线6个仿制制剂和原研制剂在30min内累积溶出量均达到75%以上。在pH7.5溶出差的4个仿制制剂在此介质中溶解性也较差,60min内的累积溶出量不足10%。4.4.4在pH4.5溶出介质中的溶出曲线原研制剂和仿制制剂在此种介质中的累积溶出量均较少,可能与替米沙坦在此介质中的溶解度很小相关。只有3个制剂的释放量超过50%,Generic1在此介质中的溶出较其他制剂好,此外有4个仿制制剂的溶出量低于定量下限,故未能绘制溶出曲线。4.4.5在pH1.2溶出介质中的溶出曲线除Generic3外,所有制剂60min内的累积溶出量均达到标示量的80%以上,但只有1个制剂30min内的累积溶出量达到75%以上。Generic360min累积溶出量少于40%。Generic5、9和10在此介质中溶出非常迅速,5min基本完全溶出。4.5溶出曲线相似度比较通过相似因子f2来定量评价仿制制剂与原研制剂溶出曲线之间的差别。若f2值在50～100之间,则表明两种制剂的溶出度相似或相同。其中n代表取样点数目,Rt和Tt分别为在t时间点的参比制剂和试验制剂平均累积溶出百分率。在pH7.5和pH4.5溶出介质中,只有Generic3和Generic8与原研制剂的溶出度相似。Generic1、4和7在水和pH1.2溶出介质中与原研制剂的溶出度相似。本研究所选的10个替米沙坦仿制制剂无一种制剂在四种溶出介质中的溶出度均与原研制剂相似。5讨论药物的体外质量在某种程度上可以反映药物在体内的疗效。尽管所有药物的含量均在规定范围内,但有些制剂显示不完全溶出的特性。药物的生物利用度取决于药物的溶解度和溶解速率,尤其是像替米沙坦这类难溶性药物。差的溶出率可能有差的生物利用度。四种仿制药(Generic2、5、9、10)在pH4.5、水和pH7.5介质中溶出差,且其在这些介质溶解度也低,说明即使延长溶出度实验时间也不会改善替米沙坦的溶出。正常人群胃内pH值约为1,因此药物制剂在pHHl.2介质中的溶出速度可预测其在胃中溶出特性。替米沙坦在大鼠胃中吸收很少,食物可减少其吸收量。因此,这些在酸性介质中溶出较好而在偏中性介质中溶出较差的替米沙坦制剂,当胃内pH升高时其生物利用度可能受到影响。赋形剂的种类或比例不同可能导致样品的溶解度和溶出速率不同。为优化替米沙坦制剂工艺,有人比较了不同的碱性物质对替米沙坦制剂的增溶作用存在显著性差异。不同的赋形剂也可影响片剂的崩解进而影响其溶出速率,通常崩解时限可部分反映药物的溶出,崩解时限越长溶出越慢。即使片剂具有相同的崩解速度,但也可因为颗粒分布不均匀导致片间的溶出差异大。药物稳定性的差异也是导致药物含量和药物溶出度差异的重要因素,特别是药物储存于高温和高湿条件下时。药物稳定性差可出现药物的吸水后硬度改变,从而影响制剂的崩解时限和溶出度。此外,制剂包装差、气候的高湿度也是影响药物制剂在溶出介质中溶出差的重要因素,故制剂企业应选用合格的药物包装材料。一般而言,药物是以无定形物或结晶形式存在,晶型是影响药物理化性质(如溶解度、稳定性等)和活性的重要因素。对于多晶型药物,不同的结晶形式可具有不同的理化特性,通常不定型晶型较稳定型晶型溶解度高,生物利用度更高。替米沙坦具有多晶型,分别为A、B、C三种晶型,其中B晶型可转换成更稳定的A晶型。各制药企业在生产替米沙坦片时可能使用不同晶型的原材料甚至是多晶型的混合物,这均可能导致溶出的差异。有研究显示印度四家替米沙坦制药企业虽然使用相同晶型(A晶型)的替米沙坦,但却显示不同的表面特性和界面现象,这都将影响替米沙坦的溶解度、溶出和生物利用度。目前,替米沙坦多晶型与溶出的关系仍有待进一步实验验证。杂质是药物生产或贮藏过程中引入的化合物,其无治疗作用并可引起不良反应,有些不良反应甚至危及生命。在原研制剂上市时,制药企业会提供活性成分、代谢产物及已知杂质的毒性研究报告。但仿制药由于活性成分的合成路线不同,药物中引入的杂质种类和含量亦可不同。本研究发现：某些替米沙坦制剂中杂质的种类和含量均超过药典规定,其制备工艺有待改进。杂质含量的增加可能会引起不可预见的毒副作用,这都将影响药物的安全性、有效性,甚至引起不必要的药物相互作用。据报道较便宜、低质量的活性药物成分和不适宜赋形剂的应用是导致药品中杂质含量增多的重要原因,此外,低水平的生产工艺也是仿制药杂质多的另一个重要原因。杂质的来源众多,如原材料、合成过程中的溶剂残留、包装材料等,这些因素在生物等效性试验中并不能反映。与此同时,一些制药企业不遵循药品生产质量管理规范,药物制备过程中所用的原料和辅料未达到药用级别,给药品质量留下安全隐患,因此,评价药物从原料到成品各环节的杂质含量应受到重视。仿制药企业需保证所使用的主要成分、辅料和其他材料质量合格,生产工艺中不会引入新的杂质。政府和制药企业应同心协力切实贯彻执行药品生产质量管理规范,确保药物上市后仍符合药典标准。本研究发现原研药和70%仿制药在pH7.5缓冲液和水中溶出较好,有些仿制药在pH1.2和pH4.5缓冲液中比原研药的溶出更好。虽然没有任何一个仿制药在四种介质中与原研药溶出均相似,但总体而言有四个仿制药在两种介质中与原研药的溶出相似。在pH7.5缓冲液和水中三个仿制药与原研药的溶出相似,而在pH1.2缓冲液中有些仿制药比原研药溶出更好,10min已基本全部溶出,但溶出也不是越快越好。有三个仿制药的杂质种类少于原研药,杂质总含量与原研药基本一致。四个仿制药(Generics2、5、9、10)溶出曲线与原研药的溶出曲线不具备可比性,在所有介质中均存在较大差异,只在pHl.2缓冲液中迅速溶出,其他介质中基本不溶出。同时,此四个仿制药杂质含量也相对较多,其中两个仿制药杂质含量超出国家限度,这提示此四个仿制药的质量有待进一步商榷。本研究具有一定的局限性,体外溶出度试验并不能完全反映体内生物利用度。即使溶解性好的药物在体内的生物利用度也不一定好,相应的体外溶出差的药物其体内生物利用度不一定差,故仍需开展体内生物利用度研究。药物的储存条件和储存时间也是影响药物溶出的重要因素,但有四个仿制药出现pH依赖的溶出特性说明这种影响的可能性小。本文未对制剂中的杂质进行结构确证定性研究,需对替米沙坦制剂中的这些杂质开展进一步研究。6结论6.1仿制药中替米沙坦的含量均达到药典标准,但某些仿制药的杂质种类和数量过多,建议相关制药企业进一步严格控制生产过程,提高药品质量。6.210个仿制药与原研药在四种溶出介质中溶出度不全相似,其中Generics2、5、9、10四个仿制药与原研药差异大,而其他仿制制剂的溶出与原研药差异较小。图4幅,表8个,参考文献95篇。