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术葡聚糖酶是水解木葡聚糖的酶。它广泛存在于自然界的细菌、真菌和软体动物中。在饲料、食品、制药行业具有良好的应用前景,己被国内外同行重点关注,并取得一些重要研究进展。
本文以蜗牛肝脏术葡聚糖酶为研究对象,研究了该酶的提取、分离、纯化、鉴定及部分理化性质,为蜗牛木葡聚糖酶序列测定、基因克隆和单克隆抗体的制各提供了基础性技术支持。
蜗牛胃、素嚷、肝脏组织经冲洗、称重、破碎,4℃条件下.用pH5.29的11/15MNa2HPO4-KH2PO4缓冲液1:4匀浆蜗牛组织,静置,离心分取提取液,硫酸铵分级分离(0℃),SDS-PAGB,建立了这些组织蛋白分级分离SDS-PAGE电泳图谱。由此,可方便地查阅蜗牛这些组织某蛋白质(亚基)的分子量、含量、分布和存在情况。
对肝脏不同部位以不同比例Na2HPO4-KH2PO4缓冲液,提取木葡聚糖酶,硫酸铵分级分离,电透析脱盐,木葡聚糖酶活测定,发现蜗牛肝脏各部位均有木葡聚糖酶的活性,但存在部位差异性。其酶活性肝脏第3部位>第1部位>第2部位>第4部位;在0℃条件下,30%硫酸铵饱和度分级到的木葡聚糖酶的比活力最高。
肝脏木葡聚糖酶提取,硫酸铵分级分离(脱盐);Sephadex G-150凝胶层析分离:DEAE—Sephadex A-50离子交换层析纯化(比活力28.43U/mg,提纯倍数7.60.
回收率6 37%。);聚丙烯酰胺凝胶制备电泳,制备到电泳纯蜗牛肝脏木葡聚糖酶。
经部分理化性质测定,该酶相对分子量约22.7KDa,最适反应温度为45C,最适pH为5.6。
本研究设计的分离纯化技术路线和方案,能很好地满足蜗牛木葡聚糖酶的提取、分离和纯化。由电泳制备的蜗牛木葡聚糖酶,达到序列测定和制各单克隆抗体的要求。