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β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是甘露聚糖降解过程中最重要的糖苷水解酶,能够随机水解甘露聚糖主链上的β-1,4-糖苷键,生成具有多种功能活性的甘露寡糖。近几年,β-甘露聚糖酶广泛用于食品、饲料、石油、化工等行业。但是,由于较低的表达水平和酶学性质的不理想,许多野生型β-甘露聚糖酶在某些行业中适应性差。因此,对β-甘露聚糖酶进行分子改造和高效表达使其更适合于工业生产应用是十分重要和必要的。本文利用理性和非理性设计技术对米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CAU432和微孢根霉(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)F518来源的β-甘露聚糖酶进行分子改造,将这些β-甘露聚糖酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达,并实现了多种富含甘露聚糖植物胶和农业废弃物的高效酶法转化。本论文的主要结果如下:(1)成功将来源于米黑根毛霉的β-甘露聚糖酶(RmMan5A)在毕赤酵母中异源表达,并将该酶用于制备部分水解瓜尔胶(PHGG)。经过168 h高密度发酵,发酵上清液中的酶活力达到85,200 U/mL。该酶在pH 7.0、65℃条件下具有最高的酶活力。随后利用该酶水解瓜尔胶,得到重均分子量(Mw)为2.5×104Da的部分水解瓜尔胶。该产品中,总膳食纤维含量为90.6%(w/w),聚合度小于7的甘露寡糖含量为24.9%(w/w)。利用乙醇梯度沉淀,将部分水解瓜尔胶分为四个组份(F1-F4)。结构分析表明,PHGGF1中半乳糖残基的分布完整规律,而其他三个组分中半乳糖残基的分布则更加随机。(2)利用定向进化技术对米黑根毛霉来源β-甘露聚糖酶(RmMan5A)进行了分子改造。经过两轮筛选,获得一个在酸性高温条件下具有较高催化活力的突变体(mRmMan5A)。该酶的最适催化条件为pH4.5、65℃,比进化前最适pH降低2.5个单位、最适温度提高10℃。在最适条件下,该酶对不同甘露聚糖底物的催化效率(kcat/Km)均提高了3倍以上。mRmMan5A中三个氨基酸残基发生突变,分别是Tyr233His、Lys264Met和Asn343Ser。进一步将该酶在毕赤酵母中进行高效表达,经过高密度发酵,mRmMan5A的表达水平达到79,680 U/mL。随后用mRmMan5A酶解经蒸汽爆破(200℃、7.5 min)预处理的棕榈粕生产甘露寡糖。甘露寡糖的总得率达34.8 g/100g绝干棕榈粕,棕榈粕中80.6%的甘露聚糖被水解。并将这一生产过程放大至公斤级试验,最终从1.0 kg绝干棕榈粕中得到261.3 g甘露寡糖产品。(3)根据与其他GH134家族β-甘露聚糖酶氨基酸序列比对,从微孢根霉来源β-甘露聚糖酶(RmMan134A)中选取7个氨基酸位点进行定点突变,发现位点Glu25、Gln36、Ser71和Asp159对该酶的酶学性质影响较为显著。在所有突变体中,突变体RmMan134AM36的比酶活力提高了108.1%,同时保留了RmMan134A其他优良的酶学性质。将突变体RmMan134AM36在毕赤酵母中进行高效表达,经过168 h高密度发酵,发酵上清液中的酶活力达到3,680 U/mL。利用该酶水解决明子胶成功制备得到决明子甘露寡糖,甘露寡糖的总得率为70.6%,半乳甘露聚糖的水解率达81.6%。产品中聚合度小于6的甘露寡糖含量占86.4%。通过活性炭柱和硅胶柱层析,从决明子甘露寡糖中分离得到7个不同的组分,经鉴定分别为甘露糖、半乳糖、甘露二糖、甘露三糖、半乳甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖。