牙胚的发育是一个长期的、复杂的生物学过程，是上皮和神经嵴来源的外胚间充质相互作用的结果。内釉上皮下方的牙乳头细胞(dental papillacells，DPCs)具有分化为成牙本质细胞和牙髓细胞的潜能，与牙本质的形成和维持有着密切的关系，是研究牙齿发育和牙髓损伤修复的良好实验模型。　　 褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的一种神经内分泌激素，其分泌具有昼夜节律性。MT不仅调节昼夜节律、性成熟及生殖、免疫反应、肿瘤及衰老，而且还调节毛发及骨骼等器官的发育，并可诱导成骨前体细胞向成骨细胞分化。视交叉上核是哺乳类动物周期活动的起点，调节松果体及其它器官的周期性活动，对牙本质节律性的生成有重要影响。最近研究发现，钟状晚期的牙乳头细胞表达褪黑素受体MT1。本课题组预实验初步证实：MT影响牙乳头细胞的增殖和分化。　　 N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿胺(N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxy kynuramine，AFMK)是MT肝外途径代谢的主要产物之一，与MT具有相同的活性基团，属于犬脲胺家族中的一员，通过酶、光化学及自由基等多种途径生成，在免疫调节及抗氧化等方面与MT具有相似的功能。目前，AFMK有关生长发育方面的研究尚缺乏相关报道。本实验拟在体外培养、鉴定牙乳头细胞的基础上，探讨MT代谢产物AFMK对大鼠牙乳头细胞增殖、分化以及基质矿化等方面的影响，为进一步阐明牙乳头细胞的发育机制提供新思路。　　 目的：体外培养、鉴定大鼠牙乳头细胞；利用AFMK刺激体外培养的牙乳头细胞，探讨其对细胞增殖、分化以及基质矿化的影响，为阐明牙乳头细胞的发育机制提供新思路。　　 材料和方法：　　 ①截取出生1天(day，d)的Sprague-Dewley(SD)大鼠的下颌骨第一磨牙段，常规石蜡包埋切片，HE染色确认牙胚所处的发育阶段。牙乳头细胞传代纯化后，倒置相差显微镜下观察细胞形态；采用SP法对细胞行波形丝蛋白和角蛋白染色，鉴定来源；绘制细胞生长曲线；检测矿化条件下细胞牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein，DSP)的表达。　　 ②用AFMK分别在DMEM培养基(AFMK浓度为1×10-25、1×10-23、1×10-21mol/l)和矿化诱导液(AFMK浓度为1×10-23、1×10-21、1×10-19mol/l)条件下刺激牙乳头细胞，分别在第1、2、3、4d，MTT比色法检测各组OD值。　　 ③应用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)试剂盒，检测AFMK(1×10-17、1×10-15、1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞2d时ALP活性。　　 ④应用免疫细胞化学染色，观察AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞10d时DSP的表达。　　 ⑤用AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞21d，分别行Von Kossa和茜素红染色，前者倒置相差显微镜下观察矿化结节，后者加入浓度为1％的盐酸酒精，酶标仪测定OD值。　　 结果：　　 ①牙乳头组织来源于钟状晚期的第一磨牙牙胚；纯化的牙乳头细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白阴性；牙乳头细胞增殖稳定，生长良好，在矿化诱导液条件下表达DSP。　　 ②MTT结果显示：DMEM培养基条件下，第1、2d时，各组OD值变化不显著(P＞0.05)。第3d时，1×10-23mol/l组OD值较对照组及1×10-27mol/l组显著增高(P＜0.05)，其余各组间无显著差异(P＞0.05)。第4d时，1×10-23mol/l组OD值较对照组及1×10-27mol/l组显著增高(P＜0.05)，1×10-25mol/l组OD值较对照组显著增高(P＜0.05)，其余各组间无显著差异(P＞0.05)；矿化诱导液条件下，第1d时，OD值随着AFMK浓度的增加有降低趋势，各组间无显著差异(P＞0.05)。第2d时，1×10-19mol/l、1×10-21mol/l组OD值均较对照组显著降低(P＜0.05)，其余各组间无显著差异(P＞0.05)。第3d时，实验各组OD值均较对照组显著降低(P＜0.05)，实验组间无显著差异(P＞0.05)。第4d时，实验组OD值均较对照组显著降低(P＜0.05)，并且1×10-19mol/l组OD值较1×10-21、1×10-23mol/l组显著降低(P＜0.05)，其余各组间无显著差异(P＞0.05)。　　 ③高浓度AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞2d，ALP活性较对照组显著增高(P＜0.05)。　　 ④AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞10d，DSP呈强阳性表达，染色阳性部位在胞浆，呈棕黄色颗粒，对照组呈弱阳性表达。　　 ⑤AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳头细胞21d，Von Kossa染色可见橘红色钙化结节，与对照组相比矿化基质形成的量无显著差异(P＞0.05)。　　 结论：　　 ①对来源于钟状晚期的大鼠牙乳头细胞进行传代培养，成功获取纯化的、功能活性正常的牙乳头细胞。　　 ②DMEM培养基条件下，AFMK促进牙乳头细胞的增殖；矿化诱导液条件下，AFMK抑制牙乳头细胞的增殖。　　 ③AFMK刺激牙乳头细胞后，ALP活性增高，DSP表达增强，提示AFMK可能参与调节牙乳头细胞向成牙本质细胞的分化。　　 ④AFMK刺激牙乳头细胞21d，对矿化基质的形成无显著影响。　　 ⑤AFMK刺激牙乳头细胞，不同条件下增殖的有效浓度以及增殖和分化之间的有效浓度存在差异。