论文部分内容阅读
目的:脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy,CAA）的病理特征是脑血管壁上有淀粉样沉积。作为其主要成分,β淀粉样肽（Amyloid beta,Aβ）是由β-和γ-分泌酶通过次序水解一种被称为淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的跨膜蛋白产生的由39到43个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。其中Aβ1-40是存在于体内的最主要的亚型,也是CAA淀粉样沉积的主要成分;Aβ1-42虽然仅占总量的10%,但却是阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）患者神经斑中的主要成分。有证据表明,血小板激活可以调节CAA的发生和发展。血小板激活和粘附于破损的血管壁是血管损伤的第一步,激活的血小板产生了外周循环中超过90%的APP,是全血检测到的Aβ的主要来源。研究表明,遗传变异和（或）代谢修饰可以加速中间体聚集状态成分的形成。另外,Aβ的代谢修饰也可以发生在AD患者大脑、大脑血管壁和血小板等组织细胞。已经证实,血小板是外周循环中Aβ的主要来源,但是对于CAA患者血小板膜上的Aβ相关淀粉样变的代谢修饰与CAA疾病病理过程中淀粉样变形成的关系缺少系统研究。本研究通过比较CAA患者和健康志愿者血小板膜上的Aβ的代谢修饰标志物特征,结合修饰类型对于Aβ淀粉样变形成的影响,探讨代谢修饰在参与CAA疾病淀粉样变形成的分子机制。方法:1.依据“经典的和修订后的与CAA相关的脑出血的波士顿诊断标准”,筛选天津医科大学总医院神经内科2014年10月至2016年10月脑淀粉样血管病患者65例,作为实验组（CAA组）;同时按照与CAA组患者年龄、性别相匹配的原则,筛选出身心健康、无主观或客观认知障碍的健康志愿者66例,作为健康对照组（HC组）。服用任何有可能影响认知的药物（包括饮酒或药物滥用）的受试者均被排除在外。抽取4 mL EDTA-2Na抗凝的静脉全血,用于血小板常规指标分析。2.抽取受试者4 mL EDTA-2Na抗凝的静脉全血,通过差速离心法提取血液中的血小板,PBS洗涤之后,将部分血小板进行硫黄素T（Thioflavin-T,ThT）荧光探针染色,用于探讨受试者血小板中淀粉样变成分是否存在。3.分离提取受试者剩余部分血小板的可溶性膜蛋白后,采用蛋白质免疫印迹技术（Western blotting）探讨CAA组和HC组血小板膜蛋白上是否存在Aβ聚合物及其聚集程度的差异。4.利用超高效液相色谱/电喷雾离子源四级杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadruple time-of-flight mass spectrometry,UPLC/ESI-Q-TOF/MS）联用技术分析CAA组和HC组血小板可溶性膜蛋白中Aβ的代谢修饰及其差异。结果:1.通过比较CAA组和HC组血小板相关指标发现,血小板计数和血小板平均体积无统计学差异（P>0.05）;但包括血小板分布宽度和大血小板比率在内的血小板指标存在统计学差异（P<0.001）,且上述两项指标CAA组均高于对照组。2.CAA组和HC组血小板ThT荧光探针染色结果阳性,表明两组血小板上均存在淀粉样物质。3.蛋白质免疫印迹技术结果表明,CAA组和HC组血小板可溶性膜蛋白上均有不同聚集程度的Aβ聚合物。CAA组的Aβ聚合物的分子量主要为15 kDa、20 kDa、43 kDa、55 kDa和72 kDa;而HC组的Aβ聚合物的分子量主要为15 kDa、20 kDa和43 kDa。4.UPLC/ESI-Q-TOF/MS结果表明:（1）CAA组15 kDa蛋白条带仅由Aβ1-40构成;HC组15 kDa蛋白条带和CAA组72 kDa蛋白条带由Aβ1-40和Aβ1-42构成;（2）CAA组和HC组血小板可溶性膜蛋白上的Aβ聚合物存在有共同的代谢修饰类型,包括甲基化、磷酸泛酰巯基乙胺化、磷酸化、Asn27脱酰胺化及乙酰化等;（3）Met35氧化修饰及Gln15脱酰胺化均仅存在于CAA组中。结论:1.CAA组和HC组血小板膜蛋白上存在有不同个数Aβ分子聚合而形成的Aβ多肽分子聚合物的现象。2.本文首次利用UPLC/ESI-Q-TOF/MS液相质谱技术,分析CAA组和HC组血小板膜Aβ的代谢修饰谱学特征,发现对照组和CAA疾病组之间Aβ代谢修饰类型存在差异,CAA患者血小板膜存在Aβ-Met35氧化修饰及Aβ-Gln15脱酰胺化修饰,功能学实验结果显示二者可能参与CAA中Aβ聚合物的形成,从分子水平解析了CAA疾病Aβ淀粉样变形成的分子机制。3.CAA组Aβ多肽分子聚合物中均存在Aβ-Met35及Aβ-Gln15脱酰胺化代谢修饰类型,两种代谢修饰标记物有可能作为辅助检查CAA的潜在生物标志物。