背景及目的蛋白4.1R首先是在成熟的红细胞中被发现的，大小为80KD细胞膜骨架蛋白分子，因为在红细胞膜蛋白SDS-PAGE后位于4.1染色条带处而得已命名。4.1R是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋白-肌动蛋白骨架网络连接起来的桥梁，对维持红细胞正常形态、粘附、脆性及生理功能中发挥重要作用，人类4.1R基因的表达缺失会导致遗传性椭圆型红细胞增多症(Hereditary elliptocytosis)，发生溶血性贫血，红细胞失去正常形态。4.1R基因敲除小鼠的红细胞膜骨架结构改变，细胞膜表面蛋白分子分布异常。近年来研究发现，4.1R及后来发现的4.1R同源家族成员4.1N、4.1G、4.1B在有核细胞中广泛表达，其中4.1N主要分布在神经系统，4.1B主要分布在脑组织，4.1G广泛分布，而4.1R则在红细胞及同样来源于骨髓多功能造血干细胞的淋巴细胞中高表达。4.1R在成熟红细胞中的功能及作用机制目前已经研究得比较深入，而4.1R在有核细胞中，特别是在T细胞中的功能及作用机制还不十分清楚。本课题组成员在前期研究中首次发现并报道了4.1R在CD4+T淋巴细胞中与免疫突触形成有关，且证实4.1R与LAT（T细胞活化连接子）直接结合并抑制ZAP-70对LAT的磷酸化，在CD4+T淋巴细胞活化和信号转导的起始阶段发挥着负调控作用。但4.1R在CD8+T淋巴细胞活化中的免疫生理效应及作用机制在国内外均未见报道。CD8+T淋巴细胞活化后形成的效应T淋巴细胞（CTL）可以直接杀伤肿瘤细胞，分泌细胞因子如：IFN-γ、IL-2等也可以间接激活机体的免疫系统来增强机体的抗肿瘤能力。鉴于CD8+T淋巴细胞在抗病毒感染、抗肿瘤免疫、急性同种异型移植等过程中重要作用，研究4.1R基因表达缺失在CD8+T淋巴细胞活化中的作用及调控机制显得十分迫切。本研究通过对美国纽约血液中心引种回国的具有C57BL/6J遗传背景的4.1R基因敲除小鼠进行培育和繁殖，利用4.1R基因敲除小鼠和4.1R表达缺失的CD8+T淋巴细胞，了解4.1R对TCR/CD3启动的CD8+T淋巴细胞活化、增殖、细胞周期、细胞因子产生及移植瘤耐受性等方面的影响，为进一步研究4.1R在CD8+T淋巴细胞活化过程中的作用机制和通路提供实验依据。方法本研究采用具有C57BL/6J遗传背景的4.1R基因敲除小鼠和野生型的C57BL/6J小鼠作为实验模型。1.无菌取小鼠的淋巴结，免疫磁珠法获得CD8+T细胞，流式检测CD8+T细胞的纯度。2.获得野生型（4.1R+/+）和4.1R基因敲除(4.1R-/-)两种CD8+T淋巴细胞，提取总RNA后反转录成cDNA，PCR反应及琼脂糖电泳进行基因型鉴定。测序鉴定CD8+T淋巴细胞中蛋白4.1R剪切体外显子组成。3.通过流式细胞仪检测4.1R+/+和4.1R-/-两种基因型CD8+T淋巴细胞表面CD69的表达，从而分析蛋白4.1R表达缺失对CD8+T淋巴细胞早期活化的影响。4.利用流式细胞检测和CCK-8的方法研究4.1R基因缺失对小鼠CD8+T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响。5.利用ELISPOT方法，检测4.1R+/+和4.1R-/-两种基因型CD8+T淋巴细胞IFN-γ、IL-2的分泌；.利用ELISA方法比较两种基因型CD8+T淋巴细胞活化后细胞上清液中IFN-γ、IL-2的浓度。在细胞水平分析蛋白4.1R表达缺失对CD8+T细胞功能的影响。6．Western Blot方法比较4.1R+/+和4.1R-/-CD8+T淋巴细胞LAT、ERK磷酸化水平来分析蛋白4.1R基因缺失对TCR/CD3下游信号的影响。7.将H22肿瘤细胞分别皮下接种于4.1R+/+和4.1R-/-两种基因型小鼠，比较两种小鼠对移植瘤的耐受性，从动物整体水平分析蛋白4.1R对CD8+T淋巴细胞功能的影响。结果1.经过磁珠分选的4.1R+/+和4.1R-/-小鼠CD8+T淋巴细胞的阳性率分别达到94%、96.4%，符合后续实验要求。2. PCR结果显示，基因敲除小鼠的CD8+T淋巴细胞中完全缺失4.1R。测序结果表明CD8+T淋巴细胞中4.1R基因序列及外显子组成与CD4+T淋巴细胞中完全相同。3.对4.1R+/+和4.1R-/-两种CD8+T淋巴细胞表面的CD69进行流式检测，结果显示两种CD8+T淋巴细胞在未受到刺激时，CD69的表达极少，但是在细胞刺激6h后，4.1R+/+和4.1R-/-小鼠CD8+T淋巴细胞的CD69的表达量分别达到14%和31.1%，4.1R表达缺失的CD8+T淋巴细胞表面的CD69显著高于4.1R+/+基因型CD8+T淋巴细胞。4.对CD8+T淋巴细胞进行CFSE染色，运用modfit软件分析流式结果，结果显示4.1R缺失的CD8+T淋巴细胞子代细胞所占比例高于野生型CD8+T淋巴细胞。CCK-8法结果也显示4.1R缺失的CD8+T淋巴细胞的细胞数高于野生型的。细胞周期实验结果显示4.1R-/-的CD8+T淋巴细胞的S和G2/M期的百分比在第24h和48h都要高于4.1R+/+的CD8+T淋巴细胞。5. ELISPOT结果显示4.1R-/-的CD8+T淋巴细胞IFN-γ、IL-2的合成水平显著高于4.1R+/+的CD8+T淋巴细胞[(134.8±8.966) vs (56.75±4.956)N=4,(682.8±47.99) vs (372.8±35.77)N=5, P<0.001]。 ELISA结果显示，4.1R-/-的CD8+T淋巴细胞IFN-γ、IL-2的分泌水平显著高于4.1R+/+的CD8+T淋巴细胞[(2650±229.4)pg/ml vs (746.8±81.79)pg/ml,N=5, P <0.001;(137.3±8.625)pg/ml vs(90.79±6.331)pg/ml, N=5, P <0.01]。6. Western blot结果表明4.1R表达缺失的CD8+T淋巴细胞LAT、ERK的磷酸化水平高于野生型CD8+T淋巴细胞。7.体内成瘤实验的结果显示4.1R基因敲除小鼠的瘤体积比野生型小鼠的瘤体积小。结论蛋白4.1R在CD8+T淋巴细胞的活化、增殖和抗肿瘤免疫中发挥负调控作用。