论文部分内容阅读
指状青霉(Penicillium digitatum)是柑橘类水果的主要致病真菌,在采摘后的加工、贮藏、运输和销售过程中引起绿霉病而造成巨大损失。甾醇14a-脱甲基化酶抑制剂(DMIs)具有良好的杀真菌效果,但是抗药性菌株的出现使得绿霉病的防治更加复杂且困难。面对这种情况,研究病原真菌的DMIs抗性分子机理具有十分重要意义。对于DMIs抗性分子机制的深入理解为发现新的药物靶标及开发新型高效药物提供基础。MFS超家族蛋白(major facilitator superfamily)是普遍存在于整个生物界的一大类转运蛋白,具有非常广泛的生理功能。许多MFS转运蛋白的底物结合特异性较低,能够运输多种底物。研究发现,微生物中这类转运蛋白基因的过量表达可能导致多药抗性。本文克隆了指状青霉中一个新的MFS转运蛋白基因——-Pdmfs2 ,探讨了该基因与指状青霉对咪酰胺药物抗性之间的关系,并进一步研究了Pdmfs2的其它功能。主要研究结果如下：1、在指状青霉中发现了一个新的MFS超家族蛋白基因,命名为Pdmfs2。该基因全长2115 bp,在211-261 bp、333-388 bp、681-731 bp、804-865 bp及1571-1875 bp处分别含有长度为51、56、51、62和305 bp的内含子序列。Pdmfs2开放阅读框长1590 bp,编码一个含有529氨基酸残基的蛋白质。PdMFS2与其它真菌中的MFS转运蛋白同源性较高,并且具有MFS 1结构域。Pdmfs2是指状青霉中报道的第二个MFS转运蛋白基因。2、利用荧光定量PCR进行了Pdmfs2基因的转录水平分析。对于Pdmfs2的本底表达水平,咪酰胺抗性菌株PdHS-F6高于咪酰胺敏感菌株PdHS-E3, PdHS-F6中Pdmfs2基因的本底转录水平是PdHS-E3的1.73倍。采用7.0μg/mL咪酰胺药物处理PdHS-F6菌株后Pdmfs2基因的表达水平上调至处理前的2.37倍,说明Pdmfs2的转录表达可以被咪酰胺诱导。3、通过根瘤农杆菌介导的指状青霉遗传转化体系,成功构建了Pdmfs2基因敲除(ΔPdmfs2)以及基因回补(COPdmfs2)突变菌株。PdHS-F6菌株中Pdmfs2基因的缺失导致对于咪酰胺药物的敏感性增加,并且ΔPdmfs2菌株中Pdmfs2基因的回补很大程度恢复了指状青霉的咪酰胺抗性。PdHS-F6野生型菌株对咪酰胺药物的ECso值为7.896 mg/L,而ΔPdmfs2菌株的ECso值下降为6.782 mg/L; COPdmfs2菌株的ECso值为7.813 mg/L。在含有5.0μg/mL和10.0μg/mL咪酰胺的PDA培养基平板上,ΔPdmfs2菌株的生长直径小于PdHS-F6及COPdmfs2菌株。这些结果表明Pdmfs2基因与指状青霉对于咪酰胺的抗性相关,其编码蛋白起着药物外排泵的作用。4、对野生型PdHS-F6、突变型ΔPdmfs2及COPdmfs2菌株的产孢率进行分析,探究了Pdmfs2对于指状青霉产孢的影响。Pdmfs2基因敲除菌株的产孢率显著小于PdHS-F6野生型菌株,并且ΔPdmfs2中Pdmfs2基因回补很大程度恢复了菌株的产孢率。PdHS-F6菌株中Pdmfs2基因的缺失导致产孢率下降约29%,说明Pdmfs2是指状青霉产孢过程所必需的基因。5、在柑橘水果表皮进行指状青霉侵染毒力测试。接种指状青霉孢子悬液于柑橘水果的表皮并培养3d后,APdmfs2菌株孢子在柑橘水果表面所产生的病斑直径为4.48 cm,小于PdHS-F6野生型菌株孢子产生的5.48 cm病斑直径以及COPdmfs2菌株孢子产生的5.44 cm病斑直径。ΔPdmfs2突变菌株对柑橘水果的侵染毒力低于PdHS-F6野生型菌株,而COPdmfs2菌株的侵染毒力与PdHS-F6相近。Pdmfs2在指状青霉侵染柑橘类水果的过程中发挥着作用。