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乳蛋白是构成牛奶营养品质的主要物质基础,牛奶中乳蛋白含量是奶业核心竞争力的重要标志。蛋白质和多肽类激素对奶牛乳蛋白合成具有重要的调控作用。Kps(Kisspeptins)是具有多种生物功能的多肽类激素,由抑癌基因KISS-1编码,其合成后在体内迅速裂解为Kp-10(Kisspeptin-10)等小肽,这些短肽通过特异性的与G蛋白偶联受体54(guanosine-binding Protein Coupled Receptor 54,GPR-54)结合而发挥作用。Kps在体内主要参与调节垂体激素分泌、季节性繁殖和能量平衡以及参与青春期启动等重要生命活动,是当前神经内分泌生理学研究的热点之一。已有研究表明Kps在一些细胞中能活化ERK1/2和mTOR等在乳蛋白合成过程中的关键信号通路,但是关于其对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,bMECs)中乳蛋白合成的影响,目前尚未有报道。因此,本实验通过分析高乳品质和低乳品质奶牛乳腺组织中Kps受体GPR54水平与β-酪蛋白(β-casein,CSN2)含量的关系,首先明确Kps受体GPR54和CSN2含量的相关性;然后分离培养bMECs,添加Kp-10和/或信号阻断剂后,研究Kp-10对bMECs中CSN2的影响及其机制。首先,通过检测高乳品质和低高乳品质奶牛乳腺组织中CSN2和GPR54基因和蛋白水平,推测Kps和乳蛋白合成的相关性,结果显示高乳品质奶牛乳腺组织中CSN2以及GPR54基因和蛋白表达均显著高于低乳品质组,相关性分析表明GPR54水平和CSN2含量呈显著正相关,由此可推测Kps可能通过其受体GPR54促进CSN2合成。然后,通过组织块儿培养法分离培养了处于泌乳期荷斯坦奶牛的bMECs,并利用CK-18抗体进行免疫荧光鉴定细胞类型、利用流式细胞术检验分离细胞的纯度,并利用荧光定量PCR和Western blot检测1-4代bMECs中CSN2和GPR54的表达情况。结果发现分离培养的细胞为bMECs并且细胞纯度高达95.11%;在1-4代bMECs中能稳定表达CSN2和GPR54。这些结果说明分离培养的bMECs纯度达到实验要求,并且细胞能稳定表达GPR54,为Kps促进CSN2的合成提供了依据。进一步,我们选用Kp-10这一小肽激素开展了后续的实验。在bMECs中研究发现添加不同浓度Kp-10(0-100 nM)后,100 nM的Kp-10能促进CSN2的基因和蛋白水平增加,GPR54的特异性阻断剂Peptide-234能抑制这种效应,说明在bMECs中Kp-10通过激活GPR54促进CSN2的合成;进一步研究发现Kp-10在bMECs中能活化mTOR、AKT、STAT5、ERK1/2等乳蛋白合成关键信号通路,利用相应的阻断剂处理后,能抑制Kp-10对CSN2合成的促进作用。以上结果表明,Kp-10在bMECs中具有促进CSN2合成的作用,而这种作用是通过激活GPR54及其下游信号mTOR、AKT、STAT5、ERK1/2来完成的。