【摘 要】
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心血管疾病是危害人类健康的重要杀手,目前临床上的药物有出血和血小板减少等副作用。以前研究表明枸杞叶多糖具有一定的抗栓活性,但由于较大的分子量导致其在跨膜运输过程中难以发挥生物活性。因此本文以枸杞叶多糖为研究对象,利用过氧化氢和抗坏血酸降解制备低分子量多糖,研究了降解对抗血小板聚集及抗凝活性的影响,并分析了降解多糖特征与活性之间的关系。其主要结果如下:(1)枸杞叶多糖的提纯及其特征结构分析:利用水提
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心血管疾病是危害人类健康的重要杀手,目前临床上的药物有出血和血小板减少等副作用。以前研究表明枸杞叶多糖具有一定的抗栓活性,但由于较大的分子量导致其在跨膜运输过程中难以发挥生物活性。因此本文以枸杞叶多糖为研究对象,利用过氧化氢和抗坏血酸降解制备低分子量多糖,研究了降解对抗血小板聚集及抗凝活性的影响,并分析了降解多糖特征与活性之间的关系。其主要结果如下:(1)枸杞叶多糖的提纯及其特征结构分析:利用水提醇沉、sevage除蛋白得到枸杞叶粗多糖,经DEAE-52纤维素柱洗脱,发现经0.2 M Na Cl溶液洗脱的多糖组分显示出最强的血小板聚集抑制活性(36.5%,0.5 mg/ml),利用Sephadex G-100柱对该组分进一步纯化得到枸杞叶多糖(LP),并测定了它的理化性质及结构。其中总糖含量达到88.0±7.3%,糖醛酸和蛋白质含量分别为29.0±4.1%,2.2±0.3%,表明LP是高度纯化的多糖,且LP是由七种单糖:阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成的杂多糖,其摩尔比为4.4:2.0:7.0:1.0:3.1:6.8:13.4,分子量(Mw)为4.63×104 Da,分子量分散系数(Mw/Mn)为1.709。(2)枸杞叶降解多糖的制备及其特化特征:利用过氧化氢和抗坏血酸溶液对LP进行降解。当过氧化氢和抗坏血酸的浓度从0增加到50 m M时,分别得到6种降解产物LP1、LP2、LP3、LP4、LP5、LP6(统称CP)。降解前后Mw从4.630×104减小到3.450×104 Da,Mw/Mn从1.709增加到2.160,表明降解能够引起LP的Mw降低且分子量分布范围的扩大;多糖的降解度3.5%(LP1)增加到25.5%(LP6),ζ电位由-8.01±0.58 m V(LP1)增加到-5.35±0.19 m V(LP6),表明高浓度的过氧化氢和抗坏血酸溶液会引起多糖链的破坏。六种降解产物的总糖(82.9–91.1%)和糖醛酸(26.9–34.6%)含量与LP几乎相同,表明降解没有显著影响总糖和糖醛酸含量。红外光谱分析表明,波长从4,000到400 cm-1,CP的主要特征峰与LP的几乎相同,此外CP的碳谱和氢谱与LP非常相似,这表明LP在降解过程中没有发生主要的官能团转变。进一步的分析证实,多糖经降解后在水溶液中从一个紧密的球形结构转变为一个随机的螺旋结构。(3)降解多糖对抗血小板聚集和抗凝活性的影响:体外实验表明,降解能显著提高LP的抗血小板聚集活性(p<0.05),降解程度最高的多糖对花生四烯酸和凝血酶诱导的血小板聚集的抑制作用在0.5 mg/ml时高于阿司匹林(88.67%vs 80.62%;69.67%vs 65.73%),抗凝实验表明LP和CP能够延长活化部分凝血活酶时间(APTT),但对凝血酶原时间(PT)影响较小,说明LP和CP能够抑制内源性凝血。LP和LP6能显著抑制环氧化酶-1(COX1)活性和血栓素A2(TXA2)产生,与LP相比,LP6的抑制作用更强(p<0.05),这表明LP和LP6通过环氧化酶途径发挥了很强的抗血小板聚集作用,并且多糖的降解增强了这种活性。对LP和CP进行糖醛酸还原后,其糖醛酸含量降低了60-70%,抗血小板聚集活性降低至40-60%,且APTT也明显缩短,表明糖醛酸的存在对抗栓活性至关重要。综上所述,枸杞叶多糖经过氧化氢和抗坏血酸降解后能够显著增强抗血小板聚集和抗凝活性,其中糖醛酸是重要的活性基团。本论文对枸杞叶降解多糖的特征及抗栓活性进行深入分析,为研究安全天然抗血小板成分提供了理论依据。
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