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基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术,通过人工构建工程化的核酸酶,对基因组目标区间序列特异性识别与切割,定点切割产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs)并通过细胞内源的同源重组(homologousrecombination,HR)或非同源末端连接(nonhomologous end-joining,NHEJ)DNA损伤修复机制,可以在细胞活体基因组DNA序列中产生碱基缺失、插入、替换等修饰的技术。基因编辑技术具有定向突变、效率高、操作简便、特异性强等特点,使其在基因功能鉴定和遗传改良应用上有着重要的意义。基因删除是指引入两个DSBs,基于NHEJ修复将两个分开的DSBs连接起来,实现DSBs之间基因片段的删除。基因替换是在基因删除的基础上,提供修复模板,基于HR途径可以实现任何设计的DNA序列的引入。microRNA(miRNA)是由具有发卡结构的pri-miRNA加工而来的一类小分子RNA,参与生物体转录和转录后水平基因的调控。基因删除可被用于创制miRNA无义突变体以研究其基因功能。本研究基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的基因编辑技术在植物中实现基因删除和基因替换,主要研究结果如下:1.基因删除技术体系的建立。以AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miR169a和pri-miR827a两端序列为目标区域,选取靶位点,构建基于双元向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导的CRISPR/Cas9编辑载体。2.基因删除突变体筛选、鉴定与表型分析。通过PCR技术检测筛选基因删除突变体,得出AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miRNA区域删除效率分别为24%和20%,测序确定其基因型,筛选出纯合删除突变体mir169a和mir827a。Northern blot实验结果表明,纯合删除突变体mir169a中miR169的表达量明显减弱。干旱胁迫处理实验表明,纯合删除突变体mir169a表现为更强的耐旱性。3.基因替换技术体系的设计与建立。基于基因删除技术体系,选取AtTFL1基因部分片段为替换目标区域,选取靶位点,构建基因删除编辑载体。基于HR修复原理,设计两段800bp左右与AtTFL1基因替换目标区域外侧序列一致的同源臂,分别连接到核定位表达盒35S:eGFP:NOS的两端,在两端分别设计和替换目标区域一致的靶位点,构建修复模板载体。4.基因替换突变体筛选、鉴定与表型分析。通过特异性引物对转基因阳性植株进行扩增,筛选出AtTFL1基因部分片段替换突变体,统计得到替换效率为0.8%。筛选出AtTFL1基因部分片段发生替换并且修复模板发生删除的突变体,观察eGFP表达。实验表明,eGFP在拟南芥叶和根中能稳定表达。5.基因删除、基因替换编辑目标突变的遗传。筛选出基因删除杂合植株和基因替换植株,对后代进行鉴定。结果表明,后代植株突变类型符合孟德尔分离定律,基因删除、基因替换编辑目标突变能够稳定遗传。本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,可以高效的实现植物基因删除并有效的创制出miRNA无义突变体。本研究在基因删除的基础上,基于HR修复原理实现了对AtTFL1特定区域的定点替换。本研究为植物miRNA功能研究和DNA序列替换及修饰提供了新的策略。