【摘 要】
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研究背景:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）又被称为退行性骨关节病,是引起中老年人关节疼痛的常见原因,滑膜炎是其主要的临床病理变化之一。Roundabout（Robo）蛋白家族成员包括Robol～4蛋白,是Slit-Robo信号通路中主要的细胞膜表面受体,在机体细胞增殖、炎症反应及血管增生过程中均发挥重要作用。OA患者滑膜组织表现为滑膜组织增生、炎细胞浸润以及血管增生,涉及多种信号通路
【基金项目】
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福建省自然科学基金（批准号:2018J01378）；
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研究背景:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）又被称为退行性骨关节病,是引起中老年人关节疼痛的常见原因,滑膜炎是其主要的临床病理变化之一。Roundabout（Robo）蛋白家族成员包括Robol～4蛋白,是Slit-Robo信号通路中主要的细胞膜表面受体,在机体细胞增殖、炎症反应及血管增生过程中均发挥重要作用。OA患者滑膜组织表现为滑膜组织增生、炎细胞浸润以及血管增生,涉及多种信号通路的激活,却鲜有Slit-Robo通路在OA滑膜组织中的研究报道。研究目的:探究Robo1～4蛋白在人正常及OA滑膜组织（Synovium,SM）和滑膜成纤维细胞（Synovial fibroblasts,SF）中的表达差异,并通过炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6刺激SF模拟体内炎症环境,探讨Robo1～4蛋白在OA滑膜组织及滑膜成纤维细胞中的表达及作用机制。研究方法:选择膝关节OA需行关节置换术患者的滑膜组织作为实验组（OA组）,膝关节韧带、半月板或软骨损伤且滑膜未发生病变、需行关节镜手术治疗者的滑膜组织作为对照组（NC组）,运用苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色、蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）、细胞培养及鉴定等实验室技术,对两组滑膜进行组织学和细胞学层面的研究,检测Robo1～4蛋白及相关信号通路的表达情况。研究结果:（1）在术中及关节镜下观察膝关节滑膜组织,OA组较NC组明显增生、肿胀,显微镜下观察滑膜组织的HE染色切片提示OA组较NC组滑膜组织和血管大量增生、炎细胞浸润。（2）用WB、IHC技术对SM中Robo1～4蛋白的表达进行检测,结果表明,与NC组相比,OA组SM中Robo1和Robo4的表达升高,而Robo2和Robo3在SM中的表达很低。用WB和IHC技术对SM中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、非协调性分子5同源蛋白B（Uncoordinated-5-homologB,UNC5B）的表达进行了检测,结果表明OA组SM较NC组VEGF表达升高,UNC5B表达无明显差异。以上结果说明OA组SM中可能存在Robo1/Robo4-VEGF依赖的血管生成。（3）使用细胞培养技术对术中获取的滑膜组织进行原代SF的分离与培养,用短串联重复序列（ShortTandem Repeat,STR）鉴定培养出的原代细胞,结果表明,体外培养出的SF细胞纯度符合下一步实验要求。（4）用WB实验对SF中Robo1～4蛋白的表达进行检测,实验结果显示Robo1～4的表达均很低,OA组与NC组无显著差异,表明OA组SM中升高的Robo1和Robo4可能并非SF所表达。（5）CCK-8细胞增殖实验结果表明,OA组SF细胞增殖活性低于NC组。经TNF-α和IL-1β刺激后OA组SF的增殖活性较NC组明显升高。用Slit2重组蛋白刺激OA组和对照组SF,两组细胞的增殖活性无明显改变。以上结果说明OA滑膜成纤维细胞中可能存在NF-κB信号通路依赖的细胞增殖活性的升高。（6）用WB实验对经TNF-α、IL-1β及IL-6刺激后的OA组SF进行检测,Robo1～4蛋白的表达无明显改变。用TNF-α或IL-1β模拟炎症环境,分别与Slit2共同作用于SF,CCK-8法测细胞增殖实验结果表明,Slit2重组蛋白对SF中TNF-α或IL-1β依赖的细胞增殖无明显影响。以上结果说明在SF中,Slit-Robo信号通路与NF-κB信号通路之间可能无直接调控作用。（7）对OA组和NC组的滑膜组织进行转录组测序分析,共筛选出差异基因3952个,其中2135个基因上调,1817个基因下调,并对差异基因进行了聚类分析。研究结论:OA患者的滑膜组织和血管显著增生,滑膜呈炎症状态,OA滑膜组织中Robo1和Robo4蛋白表达升高,说明OA滑膜组织中可能存在Robo1/4-VEGF介导的血管生成。Robo1～4蛋白在OA滑膜成纤维细胞中的表达无明显升高或降低,说明OA滑膜组织中升高的Robo1和Robo4可能并非滑膜成纤维细胞所表达。OA滑膜成纤维细胞中存在NF-κB信号通路依赖的细胞增殖活性的升高,可能是OA患者滑膜组织增生的原因之一。在滑膜成纤维细胞中,Slit-Robo信号通路与NF-κB信号通路之间可能无直接调控作用。滑膜成纤维细胞中的Slit-Robo信号通路可能不直接参与OA滑膜炎的病理进程。
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