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枇杷属蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya Lindley),是起源于我国的特色水果,具有极高的医疗保健价值。根据果肉颜色不同分为红肉枇杷和白肉枇杷,红肉枇杷果实带有橙色,果肉较紧密,果皮较厚,较耐贮运,抗逆性强;白肉枇杷果肉乳白色或淡黄色,肉质细嫩、汁多味甜,因其风味好、口感佳而更受消费者青睐。除果肉颜色外,两类枇杷果实在糖分积累,纤维素含量,口感风味也存在显著差异。迄今,枇杷基因组背景尚不清楚,与枇杷果实品质性状相关的基因鉴定鲜有研究报道。本研究以红肉枇杷及其白肉突变体枇杷为材料,通过RNA-Seq技术全面分析了两种果实间的转录水平上的差异,在此基础上开发了差异基因的EST-SSR标记和SNP位点,并利用RACE和RT-PCR技术克隆了两个与枇杷果肉品质相关基因EjSWEET15和EjAO基因,并对这两个基因进行了生物信息学分析,为枇杷果实品质形成、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位及克隆和分子标记辅助选择育种等研究奠定了理论基础。具体研究成果如下:1、本研究对野生型红肉枇杷和突变型白肉枇杷在果实转色至成熟间的4个时期(盛花期后171d、175d、180d、185d)样本进行转录组测序。除去低质量数据后共得到约9.5Gb的Clean reads,组装出61 587条Unigenes(已被上传到NCBI的Sequence Read Archive 数据库中,登陆号为:SUB919374)。在阈值为|log2Ratio|≥1和probability>0.8时,共检测到28 216个Unigenes(13 676个上调和14 540个下调)差异表达。Gene Ontology(GO)和KEGG分析表明有40个GO类别和121代谢通路显著富集,涉及次级代谢物合成、植物激素信号传导、氧化磷酸化、糖酵解、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖与核糖代谢等。此外还从中鉴定出21个与类胡萝卜素代谢相关的基因,大部分基因在盛花期后171d时在红肉枇杷果肉中的表达量要显著高于白肉枇杷。2、利用MISA软件从野生型红肉枇杷和突变型白肉枇杷在果实转录组组装数据筛选的6608个Unigenes中共分析得到7606个EST-SSR序列。根据退火温度,扩增产物大小等指标,随机选择250对合成引物对野生型红肉枇杷、突变型白肉枇杷基因组进行扩增,结果有226对扩增出清晰条带,扩增效率为90.4%。可见,通过枇杷果实转录组数据平台,发掘到可用的EST-SSR标记的效率很高。3、通过GATK软件对枇杷果实转录组全长组装序列分析,在1361个Unigenes中发现2396个SNPs位点,主要突变类型是AT突变成GC(768个),其次是GC突变成AT(726个)的碱基转换,碱基转换突变频率是碱基颠换的1.65倍。SNP在Unigenes中出现频率为2.2%,且大部分(约87%)SNPs是无义突变,有311个SNPs是错义突变。并从3个候选基因中发现了 11个SNPs与枇杷类胡萝卜素合成有关,其中至少有一个SNPs是错义突变造成编码的氨基酸发生改变。4、SWEET蛋白是近年来在真核生物中发现的一类糖转运蛋白,具有2个典型的MtN3/saliva结构域。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码SWEET蛋白的基因,命名为EjSWEET15。该基因全长1 271 bp,包含了长度为918 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为305个,所形成的蛋白质预测分子量为34.13 kDa。实时荧光定量PCR结果显示EjSWEET15在叶片和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjSWEET15基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有4处多态性位点,其中1处位于启动子区域,其余3处均位于开放阅读框内,且均造成氨基酸发生改变,推测可能对EjSWEET15的酶学活性产生影响。EjSWEET15的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实品质形成机制及枇杷遗传改良育种提供一定的理论依据。5、果实的成熟和衰老是个复杂的生物学过程,一般认为活性氧(ROS)在其中起着重要作用。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码抗坏血酸氧化酶(AO)的基因,命名为EjAO。该基因全长2 174 bp,包含了长度为1 605 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为534个,所形成的蛋白质预测分子量为59.39 kDa。实时荧光定量PCR结果显示EjAO在根和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjAO基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有五处多态性位点,其中T719C和A730C均导致氨基酸发生改变,推测可能对EjAO的酶学活性产生影响。EjAO的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实成熟与衰老机制及枇杷遗传改良育种提供了一定理论依据。