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[研究背景]肝纤维化是由慢性肝损伤引起的一种病理修复过程。在这一过程中,活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）会迁移到损伤部位,通过分泌细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）产生纤维性疤痕。当一个人长期处于肝纤维化状态时,疤痕会逐渐取代肝实质组织,最终导致肝硬化甚至肝癌。目前,针对肝纤维化尚无有效的治疗方法,清除活化的HSC可能是治疗肝纤维化的有效策略。坏死性凋亡是一种依赖于受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIP1）、RIP3的新型程序性死亡方式,以细胞肿胀裂解、质膜破裂和释放损伤相关的分子模式为特征。随着对细胞坏死性凋亡的认识不断深入,研究者发现细胞自噬能够调控坏死性凋亡的发生。既往研究表明坏死性凋亡参与肝纤维化进程,深入探讨其潜在机制具有重要意义。然而目前对于HSC坏死性凋亡与自噬之间的分子关系仍知之甚少,有待于进一步的探索和研究。本课题组前期一直致力于天然产物抗肝纤维化的机制研究。莪术醇（Curcumol）由姜黄属植物分离而来,具有抗癌、抗菌、抗病毒等多种生物活性。莪术醇发挥抑制细胞周期、诱导细胞凋亡、调节多种信号级联等抗癌作用,具有成为抗癌药物的巨大潜力。鉴于莪术醇广泛的药理作用,我们对其是否具有缓解肝纤维化的功能及潜在分子机制进行深入探讨。在本论文中,我们阐明了莪术醇对肝纤维化的改善作用,并以自噬与坏死性凋亡之间的分子关系为切入点,明确莪术醇通过调控自噬进而诱导HSC坏死性凋亡减轻肝纤维化,进一步阐明莪术醇对HSC的作用机理,为莪术醇的深入开发奠定基础。[研究方法]1.细胞水平体外实验选取HSC-LX2为研究对象,采用MTT法、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）检测试剂盒以及台盼蓝染色观察莪术醇对HSC细胞活力、毒性以及死亡情况的影响;Western blot、PCR和免疫荧光等方法检测坏死性凋亡相关基因和蛋白以及HSC活化指标的表达水平。通过 Western blot、透射电镜（transmission electron microscope,TEM）和构建mRFP-GFP-LC3双荧光质粒监测自噬流。采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）检测自噬核心因子Atg5与Atg12/Atg16L1以及坏死性凋亡指标RIP1/RIP3间的相互作用。运用Sirt1酶活试剂盒检测莪术醇对Sirt1酶活性的影响,并通过IP实验检测Sirt1对Atg5乙酰化水平的调控作用。运用Autodock-vina分子对接软件与微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）观察莪术醇是否通过与Sirt1直接结合进而调控其核质定位及酶活性。2.动物水平将44只雄性ICR小鼠随机分为6组（正常组和模型组6只,其他组别8只）,分别为:正常对照组、CCl4模型组、CCl4+莪术醇组、CCl4+VA-Lip-Sirt1-shRNA（携带 Sirt1 shRNA的维生素 a 偶联脂质体）组、CCl4+VA-Lip-Control-shRNA+莪术醇组、CCl4+VA-Lip-Sirt1-shRNA+莪术醇组。取各组小鼠血清检测肝损伤及肝纤维化相关生化指标。通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）观察肝组织结构变化,Masson、天狼猩红染色观察肝脏胶原沉积情况,免疫组化染色（α-SMA）检测HSC活化。提取肝组织总RNA和蛋白质进行肝纤维化指标的检测。运用Western blot、PCR、CO-IP及免疫荧光双染检测莪术醇对HSC自噬与坏死性凋亡相关基因的调控作用。[研究结果]莪术醇通过诱导RIP1/RIP3依赖的坏死性凋亡清除活化的HSC,且自噬途径与此过程密切相关。莪术醇促进HSC中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,降低自噬底物P62的表达诱导自噬。沉默自噬核心因子Atg5后,自噬被显著抑制,同时HSC活化相关指标的基因和蛋白表达水平显著降低,表明莪术醇通过诱导自噬抑制HSC活化减轻肝纤维化。CO-IP结果显示莪术醇通过促进Atg12-Atg5-Atg16L1复合物的形成诱导自噬体生成进而增强自噬流。有趣的是,干扰Atg5后莪术醇诱导的细胞死亡也被显著逆转,但RIP1、RIP3的蛋白表达无明显改变。进一步研究发现莪术醇通过促进Atg5与RIPs间的相互作用激活坏死体诱导HSC坏死性凋亡。此外,自噬体也是莪术醇诱导HSC坏死性凋亡所必需的。深入研究发现,赖氨酸去乙酰化酶Sirt1是HSC自噬和坏死性凋亡的上游信号机制。通过Sirt1-siRNA,Sirt1药理学激动剂SRT1720正反验证明确莪术醇通过激活Sirt1发挥诱导HSC自噬和坏死性凋亡的作用。Sirt1使Atg5去乙酰化,低乙酰化状态的Atg5不仅诱导Atg12-Atg5-Atg16L1复合物的形成,加速自噬小体的积累,而且能激活RIPs组成的坏死体,诱导HSC坏死性凋亡。接下来,我们对于莪术醇如何调控Sirt1予以探讨。利用Autodock-vina分子对接软件模拟莪术醇与Sirt1的结合,结果发现两者间具有中等的结合能力。进一步通过MST实验验证莪术醇与Sirt1之间是否存在直接结合,Kd值为1.07±0.78μM,证明莪术醇通过与Sirt1直接结合调控其核质定位和酶活性。最后,特异性敲低小鼠HSC中Sirt1,结果显示沉默Sirt1显著削弱莪术醇对小鼠肝损伤和肝纤维化的改善作用,表明莪术醇通过靶向HSC中的Sirt1恢复肝纤维化小鼠的肝组织紊乱和胶原沉积,并降低血清学肝损伤和肝纤维化指标抑制HSC活化进而缓解肝纤维化。[研究结论]莪术醇通过靶向赖氨酸去乙酰化酶Sirt1降低Atg5的乙酰化水平,诱导HSC自噬与坏死性凋亡,进而缓解肝损伤和肝纤维化。一方面,去乙酰化的Atg5通过增强其与Atg12/Atg16L1间的直接/间接结合能力,加速了自噬体的积累,而自噬体可能是莪术醇诱导HSC坏死性凋亡所必须的;另一方面,低乙酰化状态的Atg5参与RIPs组成的坏死体的激活促进HSC坏死性凋亡。本研究将HSC自噬与坏死性凋亡信号途径有机联系起来,并结合表观遗传学修饰深入探讨莪术醇抗肝纤维化的潜在分子机制,为莪术醇的深入开发及相关靶标药物的研发奠定基础。