背景胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤,胶质瘤的预后与肿瘤细胞的增殖及侵袭能力密切相关。胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是恶性程度最高的胶质瘤,尽管临床上开展了一些针对性治疗,但其临床治疗效果仍然很差。信号转导通路的激活促使肿瘤细胞的增殖和侵袭能力增强,从而导致了较差的预后。在胶质瘤中,EGFR信号通路是促进肿瘤细胞增殖和侵袭能力的主要信号通路之一EGFR信号通路通过增强肿瘤细胞的增殖能力,组织的侵袭能力,血管的生成及细胞趋化能力参与肿瘤的发生。在胶质瘤中,EGFR的高表达及突变现象发生率很高。EGFR的激活与胶质瘤的进展和临床预后密切相关。EGFR的过表达和自激活在肿瘤的发生中起到了重要作用。Leong等发现EGFR高表达为STAT5激活所必需。许多线索证实STAT5在GBM中存在激活,而且STAT5在胶质瘤的恶性表型发生过程中起到一定的作用。1.EGFR在恶性胶质瘤中通常高表达。2.基于我们以前的研究,STAT5的激活促使IL13Ra2出现表达,而IL13Ra2通常在胶质瘤中有表达。在肿瘤的微环境中,EGFR能被许多生长因子激活,而且EGFR能够激活很多信号通路。在肿瘤的发展进程的研究中,对EGFR相关信号通路的研究主要集中在核转录因子领域,例如我们下面即将展开研究讨论的STAT5.STAT5在很多组织中有表达,而且在很多恶性肿瘤中发现有STAT5的持续激活。包括血液系统恶性肿瘤、乳腺癌和前列腺癌等。但是在胶质瘤中对STAT5与增殖和侵袭能力的关系以及它在临床瘤组织中的激活现象的研究还很少。既然在胶质瘤中EGF的作用机制已明确,那么,EGF激活STAT5后,胶质瘤增殖和侵袭能力也有可能发生变化。对胶质瘤中STAT5新功能的研究可能使STAT5成为新的肿瘤标记物,并为肿瘤的治疗带来新的治疗手段,因而,研究STAT5对GBM细胞增殖和侵袭的影响是有必要的。我们此研究的目的是调查胶质瘤组织中STAT5的激活现象,并探讨在体外胶质瘤细胞中磷酸化的STAT5对细胞增殖和侵袭的影响。材料与方法1、组织芯片的制备。肿瘤样本来源于中国医科大学附属第一医院和北京天坛医院诊断为胶质瘤并接受治疗的患者的术中样本。诊断标准根据WHO标准。本研究基于赫尔辛基宣言标准,并被当地医疗机构的伦理委员会批准并同意使用来源于两所医院的组织样本进行科学研究。实验组标本来源于胶质瘤患者术中瘤组织,对照组非肿瘤样本来源于癫痫患者行颞叶切除术的脑组织。组织在切除后快速液氮冷冻,福尔马林固定,石蜡包埋。根据文献报道,用组织芯片机(Beecher Instruments, Silver Springs, MD,USA)制备组织芯片。组织芯片样本包括25例散发星形细胞瘤(Ⅱ级),27例间变星形细胞瘤(Ⅲ级)和124例胶质母细胞瘤(Ⅳ级)。在每个胶质瘤典型病变区域提取两个0.6mm孔径的组织样本,制作成由352个微点阵构成的组织芯片。另外,选取13例癫痫手术切除的非瘤脑组织制作成组织芯片,作为对照。2、免疫组化染色。用石蜡切片机将石蜡包埋的组织芯片的标本切割成厚度为4μm的切片,贴附与防脱载玻片上,65℃烘干30分钟。将石蜡切片用二甲苯脱蜡,水化,浸入EDTA中,高压锅抗原修复。3%H2O2灭活,山羊血清封闭。p-STAT5a/b(Tyr694/Tyr699) (Santa cruz Biotechnology, Inc,CA,USA)抗体1：50稀释,4℃孵育过夜。阴性对照组用山羊血清替代一抗4℃孵育过夜。HRP标记的二抗(KIT-5930, MaxVision, Fu Zhou, China)室温孵育30分钟。DAB显色5分钟。苏木素复染,Permount(BIOS, Beijing, China)封片。显微镜(Olympus Optical, Japan)观察,图像采集。免疫组化染色强度由两位病理学专家分别进行观察并结合瘤细胞阳性染色比例和染色强度进行判定。根据两位专家判定分数的均值,对p-STAT5的表达情况进行进一步的对比评估。瘤细胞阳性染色比例分级如下：0(无瘤细胞着色),1(瘤细胞着色比例<10%),2(瘤细胞着色比例为10-50%),3(瘤细胞着色比例>50%)。着色的瘤细胞比例>20%认为有STAT5的持续激活。染色强度分为0(无着色),1(弱着色,呈淡黄色),2(中等着色,呈黄褐色),3(强着色,呈棕色)。染色指数的的计算方法如下：染色指数=染色强度×阳性染色比例。染色指数≥4,被认为瘤组织中STAT5的激活水平较高,染色指数<4,被认为STAT5的激活水平较低。3、细胞培养和EGF激活实验。U87-MG为人脑星形胶质母细胞瘤细胞系,购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。U87-MG细胞用含有10%胎牛血清、100u／m1青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM完全培养基在37℃、5%C02、相对湿度为90%的培养箱中培养。在EGF刺激前,先将U87-MG细胞用含1%o胎牛血清的培养基饥饿培养12小时,然后用PBS冲洗细胞2次,再加入含100ng/ml EGF的完全培养基继续培养。在RNA干扰实验中,根据操作手册指导转染细胞完毕24小时后,再加入EGF。4、免疫荧光分析。用0.25%胰酶消化对数增长期的U87-MG细胞,制成细胞悬液,以6×103细胞／孔加入6孔细胞培养板(内放盖玻片)。24小时后移去培养基,PBS洗1次,饥饿培养过夜,替换为含100ng/mlEGF的完全培养基继续培养1小时,用4%多聚甲醛固定10分钟。0.25%Trixton X-100的PBS作用10分钟,血清封闭1小时。加入p-STAT5抗体(1：50稀释),4℃孵育过夜,Cy3标记羊抗兔抗体(1：400稀释),PBS洗3次,室温孵育2小时。用荧光显微镜Leica DMIRE2(Leica Microsystems Ltd,Germany)观测,采集图像。5、RNA干扰实验。STAT5 siRNA为Dharmacon (Dharmacon RNA Technologies, Lafayette, CO,USA)合成的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA.根据操作手册,用DharmaFECT siRNA转染试剂将100nM STAT5 siRNA转染入U87-MG细胞。ON-TARGETplus Non-targeting siRNA (Dharmacon)作为阴性对照。STAT5的沉默效率用Western Blot检测。6、Western Blot实验。按前述的方法进行细胞培养,EGF刺激及RNA干扰。EGF处理的细胞,分别在0,15,30,60,120,180,240,300分钟收集,提取细胞核蛋白。在转染STAT5 siRNA24小时后,加入EGF,再过48小时收集,提取总蛋白。Bradford法蛋白定量。8%SDS-PAGE蛋白电泳,转膜。5%脱脂奶粉封闭30分钟。以p-STAT5为-抗4℃孵育过夜,Histone 1为内参；以STAT5为-抗4℃孵育过夜,β-actin为内参。PBST冲洗3次,每次5分钟。HRP标记的二抗室温孵育2小时。PBST冲洗3次,每次5分钟,ECL发光。7、半定量RT-PCR。U87-MG细胞转染STAT5 siRNA或阴性对照siRNA24小时后,给予EGF刺激,24小时后将各组细胞RNA用Trizol一步法提取出来,并以500ngRNA为模板逆转录为cDNA,根据引物Cyclin D1:forward:5’-CTGTGCTGCGA AGTGGAAACCAT-3’;everse:5’-TTCATGGCCAGCGGGAAGACCTC-3’,COX-2: forward:5’-TTCAA ATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’;reverse:5’-AGATCAT CTCTGCCTGAGTATCTT-3’,内参P-actin:forward:5’-AAATCGTGCGTGACAT TAA-3’;reverse:5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’扩增目的基因。引物由Takara Biotechnology (Dalian, China)合成。PCR仪设定程序为94.0℃30秒,55℃30秒,72℃30秒,共进行25个循环,产物经2%琼脂糖电泳100V30分钟,紫外线成像,结果使用Sigma-Gel software进行分析。8、MTT分析。我们通过MTT法来研究STAT5 siRNA及EGF对U87-MG细胞增殖的影响。将转染24小时的细胞胰酶消化制成悬液,计数3次,向96孔板每孔加细胞悬液200μl，约含5000个细胞,然后加入EGF，对照组只加相同体积的培养基。分别在0,24,48,72,96小时取出1个96孔板,每孔加20μl 5mg/ml的MTT,37℃继续培养4小时,将培养基吸出,每孔加150μlDMSO,震荡10分钟。570nm波长检测吸光值。9、Transwell侵袭实验。将50mg/L基质胶(BD bioscience, San Jose, CA, USA)与无血清培养基以1：7比例混合,取50μl铺于Transwell小室底部膜的上室面,待凝固后进行实验。将转染24小时后的U87-MG细胞胰酶消化制成悬液计数3次,向Transwell小室上室内加细胞悬液200μl(含1%FBS),约含2000个细胞。向下室加500μl培养基(含20%FBS),再向上室及下室同时添加EGF,对照组只加同体积的培养基。24小时后,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。用甲醇和冰乙酸按1：3的比例配制成固定液,将细胞固定30分钟。风干后,用Giemsa工作液染色10分钟,200倍视野下随机选5个视野进行计数。在另外的组别中为了抑制STAT5的磷酸化,细胞用STAT5的特异磷酸化抑制剂]Lestaurtinib(CEP701,Cephalon, West Chester, PA,USA)替代siRNA进行实验。10、细胞周期分析。按上述方法进行转染及EGF刺激,在EGF刺激24小时后收集细胞,不少于1×106。PBS洗2次,70%乙醇-20℃固定12小时,PBS洗1次,碘化丙啶(PI)染色30分钟,流式细胞仪(BD FACSCalibur CellSorting System)分析。10.统计分析。11、统计学分析。不同组间的比较用单因素方差分析,所有数据都用Systat软件(Systat Software Inc.,San Jose,CA)进行统计,P<0.05具有统计学差异。结果1、在胶质瘤组织中STAT5持续激活。在细胞因子的作用下STAT5在Y694和Y699位点发生酪氨酸磷酸化,此反应是STAT5发生二聚体化,核穿梭,DNA结合和转录激活所必需的条件。因此,我们用p-STAT5(Y694/Y699)抗体进行免疫组化染色分析发现超过90%的胶质瘤样本细胞核呈阳性染色,而正常脑组织无阳性核染色。在体内p-STAT5的着色主要位于细胞核,而细胞浆染色不常见,表明STAT5活化后参与了DNA结合和转录调节。低级别胶质瘤和高级别胶质瘤之间存在STAT5激活现象的比例无明显差别(P>0.05),但p-STAT5表达强度存在显著差异(P=0.008),64%的低级别胶质瘤和87%的高级别胶质瘤呈强染色。对照组p-STAT5在细胞核中呈淡蓝色阴性染色,而在p-STAT5呈阳性染色的标本中细胞核呈棕色或暗红色。在正常脑组织中,p-STAT5呈阴性染色。在胶质瘤组织中上皮细胞几乎无p-STAT5着色。2、在人胶质瘤细胞系U87-MG中,EGF能激活STAT5。为了判断STAT5在体外胶质瘤细胞系中是否存在激活,EGF能否激活STAT5,我们使用p-STAT5抗体进行免疫荧光染色。与体内实验结果不同,在未处理的U87-MG细胞系中,p-STAT5染色主要位于细胞浆,而且表达水平很低,细胞核中未见染色。细胞经EGF刺激后,p-STAT5染色明显增强,而且都聚集到核内表达。为判明EGF是否可以促使STAT5发生磷酸化,我们将U87-MG细胞核提取出来,通过Western Blotting方法,检测p-STAT5在细胞核的表达情况。细胞经EGF刺激后,可见STAT5发生磷酸化改变,刺激15分钟后p-STAT5开始表达并达到峰值,随着时间的延长,p-STAT5表达逐渐减弱,在刺激300分钟后逐渐达到底限值。而无EGF刺激的对照组则未见p-STAT5的表达。3、STAT5 siRNA无论是否有EGF的刺激均能抑制U87-MG细胞的增殖。根据MTT实验结果,我们发现EGF能够明显促进U87-MG细胞的增殖。经STAT5 siRNA干预后,胶质瘤细胞的增殖能力明显下降,而且,STAT5 siRNA可明显减弱EGF促进细胞增殖的作用。这说明,除了p-STAT5,还有其它形式的STAT5与胶质瘤的增殖有关,而且这种形式的STAT5不依赖EGF的刺激和STAT5DNA结合力。STATs可通过控制细胞周期调节基因(例如Cyclins)使细胞增殖发生改变。STAT5通过识别CyclinD1启动子特定保守区域诱发CyclinD1表达。我们的实验结果显示,在U87-MG细胞中,EGF刺激能使CyclinD1表达增强,而STAT5 siRNA能使该途径诱导的CyclinD1的增强表达减弱。更有趣的是,即使没有EGF的刺激,STAT5 siRNA仍可使CyclinD1的表达下降。基于这些结果,我们推断,STAT5的激活(p-STAT5)是EGF刺激CyclinD1表达上调的必要因素。与上述结果一致,我们通过对胶质瘤细胞PI染色,流式细胞仪分析证实,细胞在转染STAT5 siRNA后,细胞周期出现明显的G1期阻滞,即使在EGF刺激后,仍有G1期阻滞。4、STAT5 siRNA无论是否有EGF刺激均可抑制U87.MG细胞的侵袭。为了证实STAT5在胶质瘤细胞侵袭作用中的重要性,我们用STAT5 siRNA转染U87-MG细胞系。转染后的细胞无论是否有EGF的刺激均出现侵袭能力的下降。为了阐明p-STAT5的功能,我们使用STAT5的抑制剂CEP701来抑制STAT5的磷酸化,发现CEP701对胶质瘤侵袭能力仅有轻微的抑制作用,但可以抵消EGF促进细胞侵袭的作用。这些结果说明,STAT5的激活(p-STAT5)是EGF促进细胞侵袭的必要因素。我们先前证实STAT5的活化能促进细胞增殖。为了排除细胞侵袭实验中转染STAT5 siRNA给细胞增殖带来的影响,我们在转染后的不同时间点用MTT方法检测细胞的增殖情况。在MTT实验中,第一天内STAT5siRNA对细胞的增殖影响不明显,而我们在一天内已经能够完成侵袭实验,因此推断沉默STAT5导致的细胞侵袭能力的下降并非是抑制增殖的继发效应。结论STAT5在人脑胶质瘤组织及U87-MG细胞系中均有表达；人脑胶质瘤组织中存在STAT5的激活；在体外人胶质瘤细胞系U87-MG中无STAT5的激活,但经EGF刺激能使STAT5活化;STAT5 siRNA无论是否有EGF的刺激均抑制U87-MG细胞的增殖；STAT5 siRNA无论是否有EGF刺激均可抑制U87-MG细胞的侵袭。