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目的 肿瘤患者发病率呈逐年上升的趋势，我国卫生事业发展情况统计公报:我国每年新增癌症患者160-200万。2010年Thun等人[1]统计结果显示肿瘤已成为危及人类生命的主要原因。随着诊断技术及干预治疗的进步，肿瘤病人的生存时间显著延长，因此如何改善病人的生存质量成为当前亟需解决的问题。肿瘤骨转移性疼痛多见于乳腺癌、前列腺癌及肺癌转移引起，加上原发的骨肉瘤等，均易诱发骨癌痛(CIBP)，严重干扰了病人的日常生活，并导致病人体能状态的下降及焦虑或抑郁的发生。但是对于这种慢性疼痛的产生和维持机制，我们却知之甚少。目前的治疗方法都是借鉴于非癌性疼痛治疗方案，因此，探讨骨癌痛的机制，对于今后临床上应用以及开辟其它镇痛途径，均具有重要意义。 神经生长因子(NGF)在伤害性感受器的急、慢性敏化过程中，发挥了十分重要的作用。以往的一些研究显示，感觉神经元的生理和生化状态能够被其支配组织释放的因子所改变。骨肿瘤局部肥大细胞、巨噬细胞、角化细胞、T细胞、肿瘤细胞以及肿瘤浸润的白细胞也会释放大量的神经生长因子，有研究显示肿瘤组织中白细胞比例占80％以上。而活化的白细胞能合成并释放多种高浓度的神经生长因子，因此推测NGF在肿瘤骨转移疼痛的发生发展过程中可能发挥重要作用。 阿片μ受体(MOR)激动剂是治疗癌痛的首选用药，MOR在疼痛调制中具有无可替代的作用。阿片受体是G蛋白耦联受体，它不仅是外源性阿片类药物的作用位点，也是内源性阿片物质的作用靶点，因此阿片受体的变化直接影响疼痛的发展及干预效果。 本研究拟通过大鼠胫骨注射Walker256乳腺癌瘤细胞建立大鼠骨癌痛模型，疼痛行为学、放射线、病理切片观察骨癌痛的发生、发展变化;并进一步使用westernblot和荧光定量PCR等方法，探讨骨癌痛时神经生长因子(NGF)及阿片μ受体(MOR)的变化，通过特异性受体拮抗剂阻断相应受体，观察NGF与MOR的关联;探讨神经生长因子在骨癌痛中的变化及其对阿片受体的调制作用。 材料与方法 一、实验材料 1、实验动物 雌性SD大鼠，体重200-230克 2、主要试剂及药品 Walker256大鼠乳腺癌瘤细胞 纳洛酮北京四环制药 山羊抗TrkA抗体SantaCruzBiotechnology，Inc. 兔抗NGF抗体SantaCruzBiotechnology，Inc. 山羊抗P75抗体SantaCruzBiotechnology，Inc. 兔抗MOR抗体abcam 兔抗GRK2抗体SantaCruzBiotechnology，Inc. 小鼠抗β-arrestin2抗体SantaCruzBiotechnology，Inc. 3、主要仪器 VonFrey纤毛美国Stoeling公司 BME-410A热辐射刺激仪中国医学科学院生物工程研究所 银汞混合器北京四泰新技术开发公司 酶标仪美国Bio-techinstrumeng LightCycler定量PCR仪美国Roche公司 电泳仪BIORAD-PAC300型（美国） 二、实验方法 1、动物模型 在胫骨上段将皮肤切开约1厘米小口，小心暴露胫骨，用5毫升注射器针头在胫骨钻孔，用弯曲的1毫升注射器针头轻柔探测骨髓腔，然后用微量注射器顺针孔进入骨髓腔，缓慢注入10μL含Walker256的PBS细胞悬液，共含瘤细胞数105个，注射时间为2分钟，注射完毕后迅速用银汞合剂封住针孔，分别使用75％乙醇和无菌生理盐水冲洗切口。假手术组大鼠注入等体积的PBS液，其余操作同cancer组。 2、鞘内置管 L3-L4插入无菌PE-10导管，导管插入0.5～1厘米。 3、动物分组 Sham与cancer组:疼痛行为学测试，放射线，病理切片;并进一步检测NGF、TrkA、P75、MOR蛋白及mRNA表达变化。 Sham组、sham+anti-NGF组、cancer组、cancer+anti-NGF组、cancer+NGF分别进行疼痛行为学分析并检测MOR、GRK2、β-arrestin2蛋白及mRNA表达变化。 cancer组、cancer+NGF组、cancer+anti-NGF组、cancer+anti-NGF+NTL组观察anti-NGF对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响以及纳洛酮对anti-NGF抗伤害感受作用的影响，探讨NGF与MOR的关联性。 三、统计分析 数据以均数±标准差表示，所得数据经SPSS12.0软件处理，采用独立t检验及单因素方差分析(ANOVA)，用LSD及Student-Neuman-Keuls检验进行两两比较，P＜0.05认为差异有显著性。 结果 1、行为学结果 cancer组大鼠在接种Walker瘤细胞后，毛发缺乏光泽，13天后，步态呈现跛行，经常左后足悬空或不敢着地，右后肢负重，基本停止生长，与sham组比较体重差异有显著性;cancer组大鼠在接种瘤细胞一周左右开始，自发缩足次数明显高于sham组;鞘内使用anti-NGF后，缩足次数明显少于cancer组，而使用NGF的大鼠，在接种瘤细胞后21天（鞘内置管后8天），缩足次数多于cancer组大鼠，提示NGF可加剧骨癌痛大鼠的痛敏。cancer组大鼠在接种瘤细胞一周左右开始出现热辐射潜伏期(PWL)缩短及机械痛阈(PWT)降低的趋势;接种后13天，cancer组大鼠的PWL及PWT均明显缩短或低于sham组，差异开始有显著性意义，提示大鼠胫骨接种walker256瘤细胞可导致大鼠同时出现机械性痛敏和热痛敏。鞘内使用NGF，PWL及PWT比cancer组大鼠缩短或降低，提示NGF可加剧cancer大鼠的痛敏，而鞘内使用anti-NGF，PWL及PWT比cancer组大鼠延长或增高，可显著减弱骨癌痛大鼠的机械性痛敏和热痛敏。而使用纳洛酮预处理可以翻转anti-NGF的抗伤害感受作用。提示NGF加剧骨癌痛作用可能与MOR有关。 2、大鼠DRG、脊髓NGF及其受体蛋白和mRNA表达结果 骨癌痛组和对照组大鼠脊髓及DRG神经元NGF、TrkA、P75在接种瘤细胞后21天，接种侧大鼠脊髓、DRG神经元NGF、TrkA、P75蛋白及mRNA表达均上调;与sham组及对侧(contra)DRG、脊髓相比，差异均有显著性，P＜0.01，而sham组与contra相比，差异无显著性。 3、大鼠DRG、脊髓阿片μ受体蛋白和mRNA表达结果 大鼠脊髓背角、DRG的MOR变化:在接种瘤细胞后21天，接种侧大鼠DRG神经元MOR蛋白及mRNA表达均下调;与sham组及对侧(contra)DRG相比，差异均有显著性，P＜0.01，而sham组与contra相比，差异无显著性。Sham表达量设为100％。 使用anti-NGF后，在接种瘤细胞后21天，接种侧大鼠脊髓、DRG神经元MOR蛋白及mRNA表达均上调，差异有显著性。 4、大鼠DRG、脊髓β-arrestin2、GRK2蛋白及mRNA表达结果 骨癌痛时脊髓及DRG神经元β-arrestin2、GRK2蛋白及mRNA表达明显增高，鞘内使用anti-NGF后，导致β-arrestin2、GRK2的表达降低，MOR上调。 综上:(1)大鼠胫骨注射walker256肿瘤细胞，疼痛行为学检测、影像学和病理学检查证实大鼠骨癌痛模型成功;NGF及其受体TrkA和P75蛋白及mRNA表达明显增加。(2)NGF系统参与骨癌痛:NGF加剧骨癌痛痛敏的发生，骨癌痛时MOR蛋白及mRNA表达明显降低。(3)鞘内使用anti-NGF后疼痛明显缓解，MOR蛋白及mRNA表达明显增加;使用纳洛酮预处理，可大部分翻转鞘内使用anti-NGF的抗伤害感受作用。(4)骨癌痛时脊髓及DRG神经元β-arrestin2、GRK2的表达明显增高，鞘内使用anti-NGF后，导致β-arrestin2、GRK2的表达降低，MOR上调。由于β-arrestin2、GRK2是公认调解MOR受体的重要因素，因此NGF调制MOR作用有β-arrestin2、GRK2的参与。 结论 1、大鼠骨癌痛时NGF及其受体参与痛觉调制，表达明显增加; 2、大鼠骨癌痛时阿片受体下调; 3、阻断NGF通路，阿片受体上调，疼痛缓解; 4、阻断阿片受体，anti-NGF的抗伤害感受作用基本消失;提示NGF在骨癌痛中的作用有阿片受体的参与; 5、骨癌痛大鼠β-arrestin2、GRK2表达增加，阻断NGF通路，其表达下降，提示NGF调制MOR有β-arrestin2、GRK2的参与。