论文部分内容阅读
目的:研究表明胃癌(Gastric carcinoma,GC)中存在染色体8p21-22区域高频率杂合性缺失,从该区域着手,筛选出与胃癌发病密切相关的表达序列标签(expressed sequence tags,EST),为进一步克隆与鉴定胃癌发生密切相关的新基因奠定坚实工作基础。方法:在染色体8p21区域定位查找EST,经BLAST比对分析,筛选出符合条件的10个EST,选取其中4个进行引物设计:收集28例胃癌手术切除新鲜标本,切取胃癌组织为实验组及远离癌组织(≥5cm)胃粘膜组织作为正常对照组,所有样本均经病理学确诊:分别提取胃癌及正常胃粘膜总RNA,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测EST的表达水平,筛选出在胃癌和正常胃粘膜中表达差异的EST,对所筛选出的EST进行网上电子克隆,BLAST分析及序列拼接,延伸差异表达EST的cDNA序列,对最后延伸所得到的EST cDNA序列进行生物信息学分析,判断分析该EST所代表基因的相关信息。结果:RT-PCR结果显示:EST DA931869在胃癌组织和胃正常组织中表达差异有显著性意义(P＜0.05),在胃正常组织中阳性表达率为89.28%(25/28),在胃癌组织中阳性表达率为46.43%(13/28);其中高分化胃癌中阳性表达率83.33%(5/6),明显高于中分化胃癌57.14%(4/7)和低分化胃癌26.67%(4/15),经统计学分析,差异有显著性意义(P＜0.05);无淋巴结转移胃癌阳性表达率为60.00%(9/15),有淋巴结转移胃癌阳性表达率为30.77%(4/13),无淋巴结转移胃癌阳性表达率高于有淋巴结转移胃癌,差异有显著性意义(P＜0.05)。其余3条ESTs在胃癌组织和胃正常粘膜组织中表达率及表达量基本相似,差异无显著性(P＞0.05)。RT-PCR结果灰度扫描分析显示,EST DA931869在高、中、低分化胃癌中,其平均相对表达强度分别为0.79±0.167、0.550±0.112、0.311±0.208,在正常胃粘膜组织其平均相对表达强度为1.192±0.154,EST DA931869在胃癌中的强度低于正常胃粘膜,差异具有显著性意义(P＜0.05);该EST在胃癌中的表达强度随着胃癌分化程度的降低而降低(P＜0.05);有淋巴结转移胃癌表达强度为0.266±0.142,无淋巴结转移胃癌组为0.652±0.133,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。生物信息学分析结果显示,EST DA931869定位于染色体8p21(24,200-24,215kbp之间)。Unigene数据库BLAST分析,在重叠群Hs.637673中包含EST DA931869,数字化差异表达系统分析显示,该重叠群在人类多种正常组织中均有表达。网上电子克隆结果:将EST DA931869进行网上比对,序列拼接,延伸长度为1037bp,总共拼接cDNA序列长度为1606bp,与人类基因草图进行BLAST分析,该序列定位于染色体8p21,与人类已知基因数据库比较分析,其同源性＜50%,表明该cDNA序列代表一个未知新基因,其PolyA尾位于1214-1219bp。ORF Finder预测该了一个编码71个氨基酸的开放阅读框。结论:1、EST DA931869在胃癌组织中的阳性表达率低于正常胃粘膜,胃癌中该EST表达下调或缺失。2、通过网上拼接,获得该EST所代表基因的cDNA序列延长为1606bp,该序列含有PolyA尾。3、所获cDNA序列与已知基因同源性＜50%,是一个新的未知基因cDNA序列,该基因定位于染色体8p21。