藏羚羊(Pantholops hodgsonii)和普氏原羚(Procapra przewalskii),属偶蹄目牛科原羚属,主要分布在我国青藏高原的青海、西藏和新疆,是世界上最濒危物种。体细胞重编技术给保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。体细胞重编程技术主要包括：体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)技术和诱导多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells)。但是,亲缘关系较远的物种异种克隆生产后代比较困难,这可能会归因于一些发育相关的机制的原因。本研究当中供体细胞是已经处于分化末端的藏羚羊和普氏原羚体细胞,在以牛卵母细胞作为受体胞质,构建藏羚羊-牛异种克隆重构胚(ZBNT)和普氏原羚-牛异种克隆重构胚(PBNT),研究发现在异种克隆胚胎中早期的发育的8-16细胞时期会产生发育阻滞,囊胚的发育率在1.5%之下。我们首先从胚胎发育的阻滞期做了转录组学的分析,试图找出异种克隆胚胎发育阻滞的原因。同时采用了体细胞重编程技术手段-诱导干细胞多能性技术,对藏羚羊体细胞在体外进行了多能性诱导,之后再应用到异种克隆胚胎研究当中,旨在从另外一种渠道来提高异种克隆胚胎发育效率。1、我们首先以普氏原羚的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,并且对牛同种和普氏原羚-牛异种克隆胚胎进行了转录组基因芯片分析。分析结果显示：牛-牛同种克隆胚胎基因表达与重编程相关的基因要显著高于异种克隆胚胎(1527：643)。在异种克隆胚胎中,总共有139个与转录调控相关转录调控因子(TFs)没有被激活。在同种克隆胚胎中,母源性降解相关的基因有1515个基因表达下调,而在普氏原羚-牛异种克隆胚胎当中,只有343基因下调。线粒体与核DNA互作相关的基因,特别是TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)复合物基因,在同种克隆当中有很高的表达,而在异种克隆胚胎中表达量很低。综上所述,在PBNT的异种克隆胚胎中,母源基因的不恰当的降解,转录因子的不完全激活、线粒体相关功能的基因的不正常表达可能导致细胞在异种胞质当中的重编程失败,导致异种克隆胚胎发育异常。2、在以上研究的基础上,对藏羚羊的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,并且研究了藏羚羊异种克隆胚胎的发育,并且以普氏原羚-牛、牛-牛重构胚作为对照,研究发现,藏羚羊-牛胚胎囊胚发育率为0.8%,与普氏原羚异种克隆胚胎发育率相近(1.07%),显著的低于牛同种克隆胚胎的发育(22.9%)。我们又重新设计并且重新引入了藏羚羊-牛的异种克隆胚胎(ZBNT),试图在异种克隆胚胎(ZBNT、PBNT)与同种克隆胚胎(BBNT)找出,在异种克隆胚胎发育中的共性。进而更进一步的揭示异种克隆胚胎发育阻滞的原因。对牛同种和普氏原羚-牛异种克隆胚胎、藏羚羊-牛异种克隆胚胎进行了更为全面系统的转录组基因芯片分析。结果显示：在与同种克隆胚胎相比之后,有411个基因是在异种克隆胚胎当中所特有的表达下调基因,这些基因的GO分析集中在了细胞的膜系统功能区域,包括：nuclear lumen, intracellular organelle lumen, membrane-enclosed lumen, organelle lumen等功能区域；还有核糖体发生区域,包括：ribonucleoprotein complex biogenesis, ribosome biogenesis等功能区域。之后我们分析了TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)复合物基因家族,发现在异种胚胎当中(包括藏羚羊-牛异种克隆胚胎、普氏原羚-牛异种克隆胚胎)表达整体下调,与之前所得出结论完全相符。之后我们也发现在异种克隆共同表达下调的基因当中,转录辅激活因子mediator复合物家族成员中一部分基因是非常明显的,其中mediator家族是转录起始的一个重要的结构蛋白,MED家族在异种克隆胚胎中整体表达趋势下调。此外,有关核糖体发生功能区域的基因家族,包括：ribosomal protein large subunit (RPL家族)和ribosomal protein small subunit (RPS家族),这两个家族的基因是编码核糖体大小亚基的基因家族,在异种克隆胚胎(ZBNT和PBNT)当中,有关核糖体合成相关的大小亚基表达普遍低于同种克隆胚胎(BBNT)。同样,与同种克隆胚胎相比之后,有729个基因在异种克隆胚胎中表达上调,通过GO分析之后,这些基因的主要功能集中在了nucleotide binding, purine nucleotide binding, ribonucleotide binding, purine ribonucleotide binding等相关的通路。在这些通路中HSP (Heat Shock Protein)家族基因在异种克隆胚胎中表达明显高于在同种克隆胚胎中的表达。综上所述,在ZBNT和PBNT的异种克隆胚胎中,不光是线粒体结构相关基因TOMM/TIMM(复合物基因家族表达出现了异常,而且在转录起始的作用原件MED基因家族以及胞质核糖体大小亚基发生相关基因,也会表达异常。这些基因的表达异常,也可能是导致异种克隆胚胎发育异常的,导致重编程过程失败的重要原因。另外在ZBNT和PBNT的异种克隆胚胎中,HSP (Heat Shock Protein)家族基因表达会有明显的上调,其中也包括了HSP70, HSP90的重要亚基,HSP基因家族在细胞当中扮演重要角色,对于细胞当中物质运输以及蛋白降解等机制具有重要作用。那么在异种克隆胚胎发育过程中,可能是在异种克隆胚胎发育当中,存在一定的应激机制,来促使胚胎当中的HSP的表达。综上所述,关于异种克隆胚胎当中的这些表达异常,都有可能会是异种克隆胚胎发育低下的重要原因。3、此外,我们采用了诱导干细胞多能性技术,对藏羚羊体细胞在体外进行了多能性诱导,之后再应用到异种克隆胚胎研究当中,旨在从另外一种渠道来提高异种克隆胚胎发育效率。本研究利用小鼠(Mus musculus)来源的Oct-4(又称POU Class 5 Homeobox 1,简称：POU5F1)、Sox-2 (Sex Determining Region Y-Box 2)、Klf-4 (Kruppel-Like Factor 4)和c-Myc (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog)等4种重编程因子,对藏羚羊体细胞进行诱导重编程,并将诱导后的细胞作为移植入牛去核的卵母细胞中,进行异种克隆操作,观察异种克隆胚的体外发育情况。结果表明,经过4因子诱导之后的藏羚羊细胞并没有形成ES (embryonic stem cell,简称ES细胞)样细胞克隆,但诱导之后的细胞增殖能力和形态都发生了改变。细胞周期分析发现,诱导后的藏羚羊细胞(简称iPS-ZLY细胞)进入G2-M期的比率高于藏羚羊成纤维细胞(21.5% vs 16.7%)。iPS-ZLY细胞在培养的第4天进入生长的平台期,而ZLY细胞则在第6天进入平台期。核型分析发现,iPS-ZLY的正常2n核型比例与ZLY细胞相似(68.3%vs 69.6%)。iPS-ZLY细胞表达OCT-4基因。当把iPS-ZLY细胞移植入去核的牛卵母细胞后,iPS-ZLY异种克隆桑葚胚和囊胚形成率分别为8.5%和2.4%,而ZLY异种克隆胚胎桑葚胚和囊胚形成率则分别为3.8%和0.95%。以上研究表明,经过4种因子诱导之后藏羚羊体细胞,其增殖能力发生显著改变,细胞生长周期加快,表达多能基因Oct-4；诱导细胞的异种克隆胚胎发育率显著高于普通细胞,诱导细胞对于异种克隆胚胎发育有促进作用。本研究首次利用重编程因子诱导藏羚羊体细胞,进而对诱导之后的细胞进行了包括细胞周期、染色体核型以及多能性基因的检测,虽然没有形成干细胞样细胞克隆形态,但是多能性基因Oct-4开始表达,是一个处于分化的体细胞和多能性细胞的种间状态,这样的种间状态有助于异种克隆胚胎的发育。本研究从体外诱导重编程结合异种克隆重编程对藏羚羊分化的体细胞进行试验研究,在研究重编程机理以及物种保护具有指导意义。综上所述,体细胞重编程技术主要包括：体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)和诱导多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells)。亲缘关系较远的物种通过异种克隆生产后代比较困难,这可能会归因于一些发育相关机制的原因。体细胞重编技术为保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。本文对藏羚羊和普氏原羚进行了异种核移植试验,研究发现在异种克隆胚胎发育过程中会形成发育阻滞的现象,之后研究针对于异种克隆发育过程阻滞机理以及如何提高异种克隆胚胎发育效率的问题开展了大量研究。研究的主要结果如下藏羚羊-牛和普氏原羚-牛异种克隆胚胎在发育过程中,存在发育阻滞。这可能归因于在异种克隆胚胎中,转录因子的不完全激活、转录辅激活因子mediator复合物家族、线粒体相关TOMM/ TIMM复合物基因家族、核糖体发生功能区域的基因家族,包括：RPL家族和RPS家族的不正常表达可能导致细胞在异种胞质当中的重编程失败,进而导致异种克隆胚胎发育异常。另外,异种克隆胚胎中,HSP家族基因表达会有明显的上调,其中也包括了HSP70,HSP90的重要基因,这可能和异种克隆胚胎当中的一些应激机制有关。经过4因子诱导之后的藏羚羊细胞并没有形成ES样细胞克隆。但诱导之后的细胞增殖能力和形态都发生了改变。并且,诱导之后的iPS-ZLY细胞表达OCT-4基因。当把iPS-ZLY细胞移植入去核的牛卵母细胞后,异种克隆效率有了明显的改善。以上这些研究对保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。