【摘 要】
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中国是最大的马铃薯种植和生产国,但马铃薯产业的发展一直受到各种真、细菌和病毒性病害的威胁。高效便捷的检测方法有助于淘汰潜在病原物的危害,同时保证种薯的质量,控制这些病害的传播。PCR技术被广泛应用于马铃薯病害的检测,并具有灵敏度高的特点,特别是多重PCR技术能在一个反应中同时检测多种目标病原物,极大的节约了时间和成本。因此,发展建立一种能快速检测马铃薯主要病害的多重PCR体系对种薯生产以及马铃薯产
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中国是最大的马铃薯种植和生产国,但马铃薯产业的发展一直受到各种真、细菌和病毒性病害的威胁。高效便捷的检测方法有助于淘汰潜在病原物的危害,同时保证种薯的质量,控制这些病害的传播。PCR技术被广泛应用于马铃薯病害的检测,并具有灵敏度高的特点,特别是多重PCR技术能在一个反应中同时检测多种目标病原物,极大的节约了时间和成本。因此,发展建立一种能快速检测马铃薯主要病害的多重PCR体系对种薯生产以及马铃薯产业发展具有重要意义。本实验室已经构建了能同时检测6种马铃薯主要病毒的多重PCR体系,用多重PCR技术对青枯病菌和马铃薯晚疫病菌进行同时检测的体系也已有研究,但同时检测DNA病原物（真菌、细菌）和RNA病原物（病毒）的多重PCR体系还未见报道。本研究设计和鉴定了危害马铃薯的主要病原物的特异PCR引物,包括真菌性病害（晚疫病、黑痣病、干腐病）、细菌性病害（青枯病、黑胫病、疮痂病）和病毒病（PVY、PLRV、PVX）。通过单重PCR和多重PCR两轮筛选,获得了7对扩增稳定的特异性引物,并建立了能在一个PCR反应中同时检测晚疫病（INF1/INF2）、黑痣病（BS4F/BS4R）、干腐病（Gf F/Gf R）、青枯病（Rsol F/Rsol R）、PVY（3S/4A）、PLRV（4F/4R）、PVX（4F/4R）的7种病原物的多重PCR检测体系。进一步对该体系进行优化,并确定了最佳的退火温度、模板和引物浓度、聚合酶浓度、d NTP和Mg2+浓度以及PCR增强剂等反应条件,经特异性和灵敏度检测,各病原物扩增的目标条带大小分布在100 bp～600 bp,检测灵敏度达到7×10-2ng（DNA/c DNA模板）,重复性好,证明本研究新建立的马铃薯7重PCR检测体系具有较高的特异性和灵敏性。为了进一步验证该多重PCR体系的适用性,对从田间取样的104个马铃薯块茎样品进行了检测验证,在检出的6种病害中,该体系对三种病毒病的检测较ELISA更灵敏,对青枯病和黑痣病的检测灵敏性稍低于单重PCR,但该体系能满足生产检测的需要。本研究建立的马铃薯主要病害的多重PCR检测体系首次实现了马铃薯7种主要DNA和RNA病原物的同时检测,是一种快速高效、实用准确、成本较低的马铃薯病害检测方法,为监控马铃薯脱毒种薯质量和防治马铃薯病害提供了技术支持,有利于推动我国马铃薯产业的发展。
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