研究背景与目的食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织公布的最新资料显示，2008年度全世界67亿人口新发食管癌48.2万例，发病率为7.0/10万，居全部恶性肿瘤第9位；死亡40.7万例，死亡率5.8/10万，居第8位。其发病率具有明显的地域差异，其中，东亚、东非和南非是高发地区，西非、中非及中美洲是低发区，两者相差16倍。发病率的男女性别比为3～4倍。中国大陆13.4亿人口中食管癌新发25.9万例，发病率为16.7/10万，居全国各类恶性肿瘤第5位；死亡21.1万例，死亡率为13.4/10万，居第4位。食管癌的病理类型表现为中、上三分之一的鳞状上皮细胞癌和下三分之一与胃食管交界处的腺癌。从中亚的伊朗北部到东亚的华中华南，是被称为“食管癌带”的食管癌高发区，90%以上是鳞状上皮细胞癌。近几十年来，尽管在食管癌的诊断与治疗方面新技术、新手段层出不穷，但食管癌的预后并未明显改善。究其原因在于半数以上的患者在首次就诊时已属于中晚期，而这些患者即使行以手术为主的综合治疗，仍有40%～50%患者死于复发或转移。食管早期癌治疗后5年生存率高达90%～100%,而进展期癌5年生存率低至10%左右，这与现有治疗方法对早期患者治疗的有效性有关，因此,提高食管癌患者生存率关键在于早期诊断。作为食管鳞状上皮细胞癌早期诊断的一项技术，食管拉网细胞学检查已经应用于临床，尤其是在食管癌高发区，针对大批无症状人群的筛查具有重要意义，但其灵敏度比较低（14℅～36℅），目前已被内镜下诊断加病理活检取代。理想的诊断诊断方法应该具备灵敏度高、特异性强、微创和简便易行，不需要专家的特别解释。内镜活检监测具有侵袭性且价格昂贵，操作难度大，费时费力，不能满足上述要求。目前多重活检、福尔马林固定后行免疫组化检查，可以满足上述需要。免疫组化可以对分子生物学标志物进行定性、定位及定量分析，是在组织水平上常用的诊断方法。目前用来预测可以发展为食管鳞状上皮细胞癌的分子生物学标志物主要有MCM-2、cyclin-A等，但其诊断的准确性较低，因此，鉴定食管鳞状上皮细胞癌早期诊断新的分子生物学标志物是临床亟待解决的问题。现在，高通量蛋白质组学技术可以描绘出疾病与对照之间全蛋白组水平上蛋白质的变化谱图，可以把组织、血清等多种样本作为研究对象。差异蛋白质组学通过对差异蛋白质的筛查特别适用于对疾病机制的研究，提供差异蛋白质的信息，进而鉴定出对疾病诊断、分子治疗及预后判断有关的分子生物学标志物。同位素试剂的差异标签标记技术，比如同位素相对绝对定量试剂盒(iTRAQ)结合多维液相色谱分离和串联质谱在疾病标志物的筛查及鉴定中意义日渐突出。我们采用这一方法曾对结直肠癌差异蛋白进行研究，鉴定到一组有重要意义的结直肠癌标志物。本研究采用了iTRAQ试剂盒结合多维液相色谱分离及串联质谱技术描绘了食管鳞状上皮细胞癌癌组织与正常组织之间的差异蛋白质谱，旨在鉴定到对食管鳞状上皮细胞癌有诊断意义的免疫组化标志物，以期提高早期诊断水平，进而改善患者预后。同时也为其发生发展的分子生物学机制研究提供新的线索。方法分别在手术中标本离体后收集5例食管鳞状上皮细胞癌患者癌组织和远端正常粘膜组织，蛋白提取后，分别将5例肿瘤样本蛋白及5例正常粘膜样本蛋白混合、胰酶消化后，以同位素相对与绝对定量试剂盒标记肿瘤和正常组织蛋白，混合后首先用强阳离子交换进行第一维的分离，根据峰型和时间共收取20个梯度,然后采用反相色谱与质谱联用技术对样品进行第二维的分离和蛋白质多肽质谱图的获取与定量，经数据库搜索，描绘出食管鳞状上皮细胞癌组织差异蛋白质谱。搜索Swiss-Prot与GeneOntcology数据库进行差异蛋白质亚细胞定位和功能分析。经生物信息学分析，在差异蛋白质谱中挑选一组蛋白，以免疫组织化学法检测其表达水平。收集57例食管鳞状上皮细胞癌癌组织和远端正常粘膜组织，经福尔马林固定、石蜡包埋、切片后，脱蜡至水、高压抗原修复、双氧水封闭内源性酶、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色及苏木素复染后，采用双盲法有两位病理学医师对结果进行诊断。诊断标准：在5个视野观察200个上皮细胞，对阳性细胞数和染色强度进行观察并打分，两者相加之和作为评分结果。根据阳性细胞百分比进行打分的标准：0，阴性；1，阳性细胞数<10%；2，阳性细胞数≥11%而﹤50%；3，阳性细胞数≥51%而﹤80%；4，阳性细胞数≥80%。根据染色强度进行打分的标准：0，无；1，弱阳；2，中等阳性；3，强阳性。另在手术中标本离体后收集3例食管鳞状上皮细胞癌患者癌组织和远端正常粘膜组织，蛋白提与定量取后，采用Western-Blot实验验证差异蛋白的表达。取30微克总蛋白行SDS-PAGE、转膜、一抗孵育、二抗孵育后以电化学发光法显示条带，以PD QUEST软件半定量分析。结果采用同位素相对与绝对定量、蛋白质二维分离及质谱技术描绘早期食管鳞状上皮细胞癌组织蛋白谱，共鉴定到712个蛋白，其中，P﹤0.05并且在癌组织与正常组织中含量比值≧1.5或≦0.67的蛋白质被认定为差异蛋白，共有39个蛋白（29个上调，10个下调）。利于Swiss-Prot和GeneOntcology数据库搜索，差异蛋白定位于细胞膜、细胞外基质、细胞浆和细胞核，其功能与结合、细胞结构、信号转到、细胞粘附等相关。在这些差异蛋白质中，我们选择了TP-alpha(HADHA), Collagen alpha-1(VI)chain(COL6A1)和S100A9等3个高表达蛋白质进行免疫组化实验，结果显示：TP-alpha表达于77.19℅肿瘤间质，肿瘤细胞及正常粘膜上皮细胞中不表达；Collagenalpha-1(VI) chain表达于细胞外和细胞膜，癌组织中85.96%℅阳性，正常组织中31.58℅阳性，与正常组织相比，75.44℅表达增高。S100A9表达于细胞浆，在89.47℅的肿瘤组织与66.67%正常组织中阳性，在癌组织中呈现局灶状团簇状表达，与正常组织相比，表达升高者占59.65%。通过收受者特征曲线的曲线下面积分析，分别以免疫组化评分（2、3、3分）作为诊断标准，其诊断标准、灵敏度、特异度和曲线下面积分别为：HADHA,≧2分，77.19℅，100.00℅和0.886℅；COL6A1，≧3分，71.93℅、85.96℅和0.856℅,和S100A9，≧3分，82.46℅、43.86℅和0.647℅。Western-Blot实验同样证明了HADHA、COL6A1和S100A9在癌组织中的高表达。结论我们初步描绘了食管鳞状上皮细胞癌组织差异蛋白质谱，为食管癌发生发展机制及肿瘤标志物的研究提供新的线索。HADHA、COL6A1和S100A9在癌组织中高表达，可以作为食管鳞状上皮细胞癌早期诊断免疫组化生物细胞学标志物。