猪MRPS18基因微环载体构建及真核表达

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线粒体核糖体蛋白(MRPS18)能够通过干扰B细胞的通路使其永生化,人MRPS18基因的过表达能够使大鼠胚胎成纤维细胞永生化。近年来人们采用各种方法诱导细胞永生化,目前常用的方法是将外源性永生化基因导入细胞后培养获得。永生化细胞株可用于长期制备或利用某个蛋白。载体是将目的基因转入细胞的主要工具,与其他载体相比,微环载体既没有细菌的复制原点,又不含抗性基因,而且表达绿色荧光蛋白,便于观察跟踪,具备转染效率高,低免疫原性,体内长期表达等优点,是一个高效的真核表达载体。本研究通过RT-PCR方法从猪肝脏组织中克隆了MRPS18基因片段,并将该基因片段与微环表达载体Minicircle进行连接,构建成微环载体Minicircle-MRPS18,然后转染Hela细胞,在细胞水平上检测MRPS18的表达情况及其对细胞永生化的影响。结果表明,克隆的猪MRPS18基因长度为800bp,编码258个氨基酸,蛋白质分子量为67.39kDa,等电点为4.84,且在脑、心、肝、肾、脂肪、胃肠、肌肉等组织表达,其中肾、肺、脂肪组织分布量较高,脑和直肠组织分布量较低,并成功构建了该基因的微环表达载体;转染Hela细胞后,RT-PCR检测发现MRPS18基因实现了过表达;微环表达载体Minicircle-MRPS18中绿色荧光蛋白的持续表达时间为22d;在阿霉素刺激细胞衰老试验中,β-半乳糖苷酶活性结果表明MRPS18能够一定程度延缓细胞的衰老;MRPS18能够促进TERT的表达,升高端粒酶活性。
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