论文部分内容阅读
霉菌在自然界分布很广，很容易污染食品。霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次生代谢产物，造成误食人畜霉菌毒素中毒。据估计，每年全世界有25％的粮食作物受到霉菌毒素的污染。赭曲霉毒素A(OTA)是霉菌毒素的一种，通常是由疣状青霉、赭曲霉和炭黑曲霉等霉菌所产生的。OTA广泛存在于谷类、豆类、干果、咖啡、啤酒、葡萄酒等食品中。OTA具有多种毒性，如肾毒性、肝毒性、免疫毒性、骨髓毒性、神经毒性、致畸性和致癌性。基于上述原因，国际癌症研究机构将OTA列为可能的人类致癌物(2B类)。因此，快速、准确地测定OTA具有重要意义。 对于OTA的检测，除了以高效液相色谱.荧光检测为标准方法，还开发了很多其他的检测方法。自OTA核酸适配体被筛选出来，以OTA核酸适配体为识别单元的生物传感器受到广泛的关注。本论文介绍了三种基于OTA核酸适配体的生物传感方法用于检测OTA。 1.建立了以未修饰的金纳米粒子为指示剂的核酸适配体比色传感方法用以检测OTA。单链DNA具有保护金纳米粒子、抑制高浓度盐诱导金纳米粒子聚集的能力。通过圆二色光谱实验首次证实，在含有镁离子的磷酸缓冲液中，OTA可诱导其核酸适配体的构象从无规卷曲转变为反平行G-四链体，而这种刚性的G-四连体结构不能保护金纳米粒子以抵制高浓度盐对金纳米粒子的诱导聚集作用。溶液中OTA适配体形成反平行G-四链体结构的比例和OTA的浓度呈线性关系。随OTA浓度的增大，金纳米粒子溶液从红色变到蓝色，并且此颜色变化肉眼可辨。此方法简单、快速，仅需5分钟即可完成检测。 2.介绍了以功能化核酸为生物识别单元的适配体-DNAzyme复合发卡式生物传感技术，用以检测OTA。所用发卡式DNA包括OTA适配体、类辣根过氧化物酶(HRP)的DNA酶、以及在发卡式结构的茎部可与OTA适配体及DNA酶互补的封闭链。封闭链使得DN’A酶失去了类辣根过氧化物酶的部分活性。当OTA存在时，OTA与其适配体形成稳定的配合物，从而使发卡式结构打开，被释放的DNA酶恢复活性。被释放出来的DNA酶的量的多少与OTA的浓度相对应，因此可以用DNA酶的量间接显示OTA的浓度。 3.开发了一种新型的基于适配体的生物传感方法，用于检测OTA。该方法采用两条部分互补的DNA链，其中一条DNA链(N1)包括具有类辣根过氧化物酶(HRP)催化活性的DNA过氧化物酶和OTA适配体两段序列；另一条(B2)为封闭链，包括两段分别与DNA过氧化物酶和OTA适配体有九个碱基互补的序列。OTA与其适配体相互作用，诱导OTA的适配体形成反平行G四链体结构。钾离子诱导选定的富G寡核苷酸形成平行G四链体结构，进而和血红素结合形成类辣根过氧化物酶(HRP)催化活性的DNA过氧化物酶。当有OTA存在时，由于N1形成两组G四链体结构，碱基被包裹在该结构中，不易与B2杂交，此时自由的DNA过氧化物酶的量较多，表观活性较强。当无OTA时，N1只形成一组G四链体结构，此时OTA适配体处于自由单链状态，易与B2进行杂交，进而使得B2更容易与形成G四链体部分的DNA杂交，从而使DNA过氧化物酶的量较少，表观活性较弱。 以上三种检测方法简单、快速、廉价，在使用酶标仪和96微孔板时，可实现大量样品的高通量检测。基于这些方法可开发试剂盒，用于实际样品检测。 在对葡萄酒样品的检测过程中发现，由于葡萄酒成分复杂，经简单的液液萃取无法满足上诉基于OTA核酸适配体识别、DNA过氧化物酶显色的比色生物测定方法来检测OTA的浓度。为此开发了甲苯、氯仿双组液液萃取方案，从葡萄酒中纯化提取OTA。本纯化方案较免疫亲和柱和其它各种纯化柱来说，具有快速、高效、低成本、易操作等优点，并且能够满足欧洲标准的要求，可以实现葡萄酒中OTA的纯化，并通过简单的检测方法进行测定。