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深静脉血栓形成是多系统、多因素、多基因参与的疾病,涉及静脉内皮、血小板、白细胞、凝血因子、纤溶因子等诸多角色参与,其中静脉内皮SIRT1、P-Selectin、PSGL-1、vWF、TM、TF等众多基因表达变化在DVT形成过程中起着重要作用。本课题组前期在建立C57BL/6小鼠DVT模型的基础上,通过高通量测序对静脉内皮血栓形成/不形成相关基因进行了筛选分析,发现与NC组相比,DVT 组 Mmp-12、Mmp-13 表达上调;与 Blank 组相比,Klf15-siRNA 组 Klf15表达下调,Mmp-12、Mmp-13表达上调,血栓湿重明显增加。有研究报道动脉血栓形成过程中KLF15可竞争性抑制NF-κ B信号通路使血管炎症减轻进而抑制血栓形成,同时发现Mmp-12、Mmp-13可影响动脉血栓形成。因此本课题旨在研究:1、KLF15 对 MMP-12、MMP-13 表达的影响。2、Mmp-12、Mmp-13对深静脉血栓形成的影响。3、Klf15影响Mmp-12、Mmp-13表达进而对深静脉血栓形成的影响。[目的]1、将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)进行细胞培养,构建质粒PCMV3-KLF15-over转染HUVECs、KLF15-siRNA片段转染HUVECs干扰KLF15基因的表达。real-time PCR、Western Blot检测下游MMP-12、MMP-13表达变化。探讨KLF15是否能够调控MMP-12、MMP-13表达。2、在小动物麻醉系统(R510-25)作用下,采用下腔静脉狭窄法构建C57BL/6小鼠DVT模型;合成Mmp-12-siRNA、Mmp-13-siRNA片段,尾静脉注射干预C57BL/6小鼠Mmp-12、Mmp-13基因表达,造模后24小时观察比较各组C57BL/6小鼠DVT模型的死亡率、成栓率、下腔静脉血栓长度、湿重等指标。采用real-time-PCR检测各组C57BL/6小鼠静脉内皮组织中Mmp-12、Mmp-13表达变化,探讨Mmp-12、Mmp-13对小鼠DVT形成的影响。[材料与方法]第一部分:将HUVECs进行细胞培养,构建质粒PCMV3-KLF15-over转染HUVECs、KLF15-siRNA片段转染HUVECs干扰KLF15基因的表达,检测下游MMP-12、MMP-13表达变化。1、将HUVECs进行细胞培养,构建质粒PCMV3-KLF 15-over转染HUVECs、KLF15-siRNA片段转染HUVECs干扰KLF15基因的表达。Trizol氯仿法提取 HUVECs 总 RNA,real-time PCR 法将 HUVECs 的 RNA 逆转录为 cDNA。以 GAPDH 为内参照,采用 real-time PCR、Western Blot 检测 HUVECs 中MMP-12、MMP-13的表达变化。2.采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据,综合分析KLF15对MMP-12、MMP-13对表达的影响。第二部分:狭窄法构建C57BL/6小鼠深静脉血栓形成模型,观察Mmp-12-siRNA、Mmp-13-siRNA对小鼠血栓形成的影响。1、选取C57BL/6小鼠50只,SPF级动物房饲养,不限性别,体重约24-26g,随机分为5组,每组各10只。NC组(A组,n=10)、DVT组(B组n=10)、Blank 组(C 组,n=10)、Mmp-12-siRNA 组(D 组,n=10)、Mmp-13-siRNA组(E组,n=10)。NC组、DVT组造模前24h不予以任何处理;Blank组于造模前24h尾静脉注射200ul生理盐水;Mmp-12-siRNA组、Mmp-13-siRNA组于造模前24h各尾静脉注射200μl Mmp-12-siRNA、Mmp-1 3-siRNA。2、尾静脉注射24小时后采用小鼠下腔静脉狭窄法构建小鼠下腔静脉血栓模型,于造模后24h解剖取出血栓及形成血栓部位血管内皮组织,采用real-time PCR检测静脉内皮Mmp-12、Mmp-13表达变化情况并测量血栓相关指标。3、采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据,综合分析讨论Mmp-12、Mmp-13对小鼠深静脉血栓形成的影响。[结果]实验一:将HUVECs进行细胞培养,构建质粒PCMV3-KLF15-over转染HUVECs、KLF1 5-siRNA干扰HUVECs基因的表达,检测下游基因的表达变化。1、采用 real-time PCR、Western Blot 检测下游 HUVECs 中 Mmp-12、Mmp-13的表达变化。通过蛋白条带分析得出,与NCl相比,PCMV3-KLF15-over组KLF-15表达明显上调;与NC2组相比,KLF15-siRNA组KLF-15表达明显下调。与 NC1 相比,PCMV3-KLF15-over 组MMP-12 明显下调;与 NC2 组相比,KLF15-siRNA 组 MMP-12 表达明显上调。与 NC1 相比,PCMV3-KLF15-over 组 MMP-13明显下调;与NC2组相比,KLF15-siRNA组MMP-13表达明显上调。通过统计学分析得出,PCMV3-KLF15-over组与NC1组相比,KLF15蛋白表达明显增加,有统计学意义(P<0.05);KLF15-siRNA组与NC2组相比KLF15蛋白表达明显降低,有统计学意义(P<0.05)。PCMV3-KLF15-over组与NCl组相比,MMP-12蛋白表达未尽明显差异,无统计学意义(P>0.05);KLF15-siRNA组与NC2组相比,MMP-12蛋白表达明显增加,有统计学意义(P<0.05)。PCMV3-KLF15-over组与NC1组相比,MMP-13蛋白表达明显减少,有统计学意义(P<0.05);KLF15-siRNA组与NC2组相比,MMP-12蛋白表达明显增加,有统计学意义(P<0.05)。实验二:狭窄法构建C57BL/6小鼠深静脉血栓形成模型,观察Mmp-12-siRNA、Mmp-13-siRNA对小鼠血栓形成的影响。(1)麻醉效果:麻醉过程中分别予以不同浓度异氟烷麻醉剂进行诱导麻醉和维持麻醉,小鼠麻醉深度满意,麻醉过程中无小鼠死亡。(2)尾静脉注射:静脉注射时选取左侧尾静脉注射。A组、B组未进行尾静脉注射;C组、D组尾静脉注射成功均为9只,成功率均为90%;E组尾静脉注射成功10只,成功率为100%。(3)各组C57BL/6小鼠造模成功情况:A组未造模;B组成功造模9只,成功率90%;C组成功造模8只,成功率89%;D组成功造模9只,成功率90%;E组成功造模10只,成功率1 00%。(4)各组小鼠死亡情况:A组小鼠死亡0只,死亡率为0%;B组、C组死亡1只,死亡率为11%;D组、E组死亡0只,死亡率为0%。(5)各组小鼠成栓率:A组小鼠成栓率为0%,B、C、D、E组小鼠成栓率分别为 89%、87%、67%、70%。(6)各组小鼠下腔静脉Mmp-12、Mmp-13表达情况:与C组相比,D组、E组Mmp-12-mRNA、Mmp-13-mRNA 表达降低,有统计学意义(P<0.05)。(7)各组小鼠血栓湿重、长度、湿重/长度值:A组小鼠未经造模,均未成栓。B 组、C 组、D 组、E 组血栓湿重分别为 14.81±3.15 mg、13.50±08.73 mg、6.70±1.85 mg、3.10±1.13 mg。与C组血栓湿重相比,D组血栓湿重无统计学意义(P>0.05),E组血栓湿重明显减轻,有统计学意义(P<0.05)。B组、C 组、D 组、E 组血栓长度分别为 5.20±0.87 mm、4.15± 1.93 mm、2.40±0.43 mm、2.38±0.83 mm,与C组血栓长度相比,E组血栓长度明显变短,有统计学意义(P<0.05)。B组、C组、D组、E组湿重/长度分别为2.85±0.41、3.01±0.63、2.91±1.25、1.35±0.56,与C组湿重/长度相比,E组湿重/长度明显减小,有统计学意义(P<0.05)。[结论]1、在HUVECs上KLF15可能调控MMP-12、MMP-13表达。2、在小鼠上Mmp-13可能促进DVT形成。3、Klf15可能通过调控Mmp-13的表达进而影响DVT形成。