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黄病毒科病毒是一类单链正义RNA病毒,可引起多种重要的人和动物传染病。该家族的许多成员是虫媒病毒,通过蚊子和蜱等节肢动物作为载体进行传播。日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKV)和登革热病毒(DENV)是对人类健康产生重大影响的黄病毒属病毒。有研究表明,真核生物miRNA在病毒的复制和传播中起重要作用。宿主miRNA的表达和靶向结合病毒基因组能够参与细胞的抗病毒免疫反应。很多时候,宿主miRNA在病毒的生命周期中通过复杂的调控途径来促进或抑制其对宿主的感染。miRNA也可以由病毒基因组编码并在宿主细胞中表达,病毒miRNA可以与宿主miRNA拥有共同的序列,或者具有完全不同的序列。因此,黄病毒科病毒调控宿主miRNA的表达和功能对疾病的发生具有极其重要的作用。黄病毒科病毒调控miRNA产生的研究报道已有很多,但通过其NS3的解旋酶功能对miRNA产生调控的研究还未见报道。在本研究中,首先我们通过高通量测序数据分析感染日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的鼠脑组织和小鼠神经元细胞,发现JEV感染后导致宿主细胞中整体miRNA的表达水平发生下调。我们通过添加转录抑制剂Favipiravir(T-705)、α-鹅膏蕈碱(α-Amanitin)和翻译抑制剂环己酰亚胺(CHX)的实验发现,宿主miRNA表达下调是由于JEV感染后翻译的蛋白质所导致的。为了进一步确定哪种病毒蛋白调控宿主miRNA的降解,我们构建了表达JEV结构蛋白(E、C、PrM)和非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)的10种pcDNA3.1表达载体。将这10种载体分别转染NA细胞,待48 h后检测其对宿主细胞miR-466d-3p表达的影响,发现JEV的NS3能够显著下调miR-466d-3p的表达。随后构建了其他黄病毒科病毒NS3的表达载体,发现ZIKV、WNV、DENV1、CSFV和HCV都能够不同程度的下调miR-466d-3p的表达。通过NS3的siRNA抑制试验以及病毒NTPase和解旋酶化学抑制剂DRB(5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-1H-benzimidazole)和伊维菌素(Ivermectin,IVER)处理发现NS3的解旋酶活性能够下调宿主miRNA的表达。已有研究表明,阻碍RISC沉默复合体蛋白Dicer和Argonaute蛋白的活性会抑制miRNA的顺利产生。我们利用qRT-PCR的方法检测了RISC中主要组成蛋白基因的表达。结果显示组成RISC沉默复合体蛋白的表达在JEV感染后均发生了不同程度的上调,表明JEV NS3不是通过影响RISC沉默复合体的活性来抑制宿主神经元细胞miRNA的表达。其次,通过解旋酶阻断试验和miRNA体外双链解旋试验的结果表明,NS3可以导致pre-miR-466d的双链结构解开并导致成熟miRNA功能异常。通过建模和RNA免疫沉淀实验,我们发现NS3解旋酶区域的精氨酸富集结构域对premiRNA的结合和宿主miRNA的降解至关重要。对NS3解旋酶区域精氨酸富集结构域保守氨基酸位点定点突变的实验结果显示,R226G和R202W显著降低了与pre-miR-466d的结合和降解能力。综上所述,黄病毒属病毒NS3的解旋酶功能对宿主细胞miRNA的产生具有至关重要的调控作用,为揭示病毒和宿主miRNA的相互作用和抗病毒免疫反应提供了新的途径。