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研究背景肺泡上皮细胞凋亡是COPD发病的重要机制之一。内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡途径是一条新的细胞凋亡途径。有关ERS标志性分子GRP78的生物学功能的研究已经引起生物学家们的广泛重视,GRP78在ERS时表达增加,被认为可以减轻ERS,从而减少细胞凋亡。GRP78表达上调的信号传导通路目前不完全清楚,有研究提示p38MAPK途径可以上调GRP78的表达。吸烟是COPD最重要的发病因素。香烟烟雾中富含氧自由基和多种毒性成分,氧化应激和毒性物质都是ERS的诱发因素,因此吸烟很可能触发ERS。国内外研究均证实,在COPD中,香烟烟雾可以引起p38MAPK的活化。结合上述研究,我们推测在COPD发生过程中,吸烟可能通过诱导ERS导致肺泡上皮细胞凋亡从而参与COPD肺气肿的形成,在此过程中GRP78表达上调,发挥抗凋亡作用,p38MAPK途径在香烟烟雾诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中起重要的调控作用。本研究拟以COPD大鼠及香烟烟雾提取物(CSE)干预的A549细胞为主要模型,探讨香烟烟雾诱导ERS的发生、GRP78的抗凋亡作用以及p38MAPK途径在GRP78表达过程中的调控作用。第一章COPD大鼠肺组织内质网应激与细胞凋亡目的观察COPD大鼠肺组织内质网应激的发生及肺泡上皮细胞的凋亡情况。方法24只Wistar大鼠随机均分为2组：正常对照组和COPD模型组。采用被动吸烟加气管内注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。造模完成后,测定各组大鼠的肺功能、观察肺组织病理学变化、免疫组化检测GRP78在肺组织中的表达和分布,RT-PCR检测GRP78、CHOP mRNA水平,Western blot检测GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白水平。TUNEL法检测肺泡上皮细胞凋亡结果COPD模型组大鼠FEV0.3/FVC (%)、动态肺顺应性(Cdyn)均较对照组明显降低,而气道阻力(RI)明显增高；免疫组化结果显示GRP78表达于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等细胞的细胞浆中,以肺泡上皮细胞明显。对照组GRP78呈弱阳性表达,阳性产物为棕黄色颗粒；模型组GRP78呈强阳性表达,阳性产物为棕褐色颗粒。与对照组相比,模型组肺组织GRP78表达显著增高；RT-PCR结果显示COPD模型组大鼠支气管肺组织中GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达量较对照组显著增高；Western blot结果显示COPD模型组大鼠肺组织中GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白表达较正常对照组显著增高；TUNEL法结果显示COPD模型组肺泡上皮细胞凋亡指数较正常对照组显著增高。结论采用被动吸烟加气管内注射脂多糖的方法,成功复制出了COPD大鼠模型;COPD大鼠肺组织发生了内质网应激,尤以肺泡上皮细胞明显；COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡增加,内质网应激可能是介导肺泡上皮细胞发生凋亡的重要途径。第二章香烟烟雾提取物诱导肺泡上皮细胞GRP78的表达及其抗凋亡作用目的观察CSE对A549细胞GRP78表达的影响,并探讨GRP78抗细胞凋亡作用。方法第一部分,体外培养A549细胞,给予不同浓度(0%-10%)和不同时间(0h-24h)的CSE干预后,以RT-PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白表达；第二部分,将A549细胞分为四个处理组：对照组,5%CSE组,GRP78siRNA+5%CSE组,control siRNA+5%CSE组。以RT-PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白的表达水平,Western blot检测active caspase-3蛋白表达水平,TUNEL检测A549细胞凋亡指数(AI)的变化。结果随着CSE浓度的增加或干预时间的延长,A549细胞GRP78 mRNA及GRP78蛋白表达量逐渐增加,以5%CSE、干预12h组增加最明显,但继续增加CSE浓度或延长干预时间,GRP78表达并不增加,反而下降；小干扰GRP78后,RT-PCR、Western blot检测小干扰组GRP78表达显著下降,GRP78siRNA成功下调了GRP78基因表达；GRP78水平下调后,A549细胞active caspase-3的蛋白表达水平和细胞凋亡指数与单纯的CSE刺激组比较显著升高。结论低浓度、短时间CSE刺激后,A549细胞启动了保护性的非折叠蛋白反应,GRP78表达上调。但高浓度、长时间CSE刺激,内质网出现功能障碍,其保护机制失代偿,GRP78表达反而下降；GRP78抵抗香烟烟雾提取物诱导的A549细胞凋亡。第三章p38MAPK在香烟烟雾提取物诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中的调控目的明确p38MAPK在CSE诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中的调控作用。方法第一部分,24只Wistar大鼠随机均分为2组：正常对照组和COPD模型组。采用被动吸烟加气管内注射脂多糖法建立大鼠COPD模型。造模完成后,Western blot检测各组大鼠肺组织内P-p38、GRP78蛋白表达水平,并将二者进行相关性分析；第二部分,将A549细胞分为三个处理组：对照组,5%CSE组,SB203580+5%CSE组,以RT-PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白的表达水平变化。结果COPD模型组大鼠支气管肺组织中P-p38蛋白表达水平较对照组显著升高,且P-p38蛋白水平与GRP78蛋白表达呈正相关(r=0.848, P<0.01); p38MAPK抑制剂SB203580干预后,P-p38蛋白表达水平显著降低。抑制了p38MAPK通路活化后再给予CSE干预,GRP78 mRNA及GRP78蛋白表达水平较单纯的CSE刺激组显著降低。结论COPD中p38MAPK途径发生了磷酸化激活；p38MAPK途径能上调香烟烟雾提取物诱导的GRP78表达水平。