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干扰素是由多种细胞分泌的蛋白家族成员之一,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤细胞增殖和免疫调节等生物学功能。根据干扰素的核苷酸序列和染色体定位,及其与特定受体的相互作用方式、结构与理化性质等,干扰素可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3大类。干扰素α属Ⅰ型干扰素家族,是由白细胞分泌产生的一种糖蛋白,具有较高的抗病毒活性,在试验研究和抗病毒治疗中具有很高的临床应用价值。干扰素也存在半衰期短、给药频繁等缺陷,限制了它的临床应用。血清白蛋白是天然存在于动物体内的一类大分子蛋白质,具有性质稳定和半衰期长的特点,在维持胶体渗透压、运输物质和清除自由基等方面有着重要的生理作用,适合用来与干扰素融合表达以延长干扰素的半衰期。本试验通过大肠杆菌表达系统和昆虫/杆状病毒表达系统表达犬干扰素α2,并鉴定其抗病毒活性;再在昆虫/杆状病毒表达系统中分泌表达犬血清白蛋白与犬干扰素α2的融合干扰素,并进一步检测其抗病毒活性,为犬干扰素的研究与临床应用奠定基础。试验1、犬干扰素α2在大肠杆菌的表达与抗病毒活性分析根据Genbank公布的犬干扰素α2序列(M28625.1),设计并合成编码犬干扰素α2(CaIFN-α2)的成熟蛋白基因,同时引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。将合成的CaIFN-α2基因插入表达载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a-CaIFN-α2。将鉴定正确的表达质粒pET-28a-CaIFN-α2转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western bolt分析可见分子量约为23 kDa的目的蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。蛋白包涵体经变性、复性和纯化后,获得的重组CaIFN-α2纯度为92%。用犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性为3.16×106U/ml。本试验成功构建pET-28a-CaIFN-α2表达质粒,并在大肠杆菌中实现表达,表达的重组CaIFN-α2具有较好的抗病毒活性,为进一步研究新型犬用干扰素制品提供了依据。试验2、犬干扰素α2在昆虫细胞的表达与抗病毒活性测定本试验将合成的编码CaIFN-α2成熟蛋白基因插入pFastBacHTA载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-CaIFN-α2,并转染Sf 9细胞后收获重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2。rBac-CaIFN-α2传至第3代后,用P3代rBac-CaIFN-α2感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析CaIFN-α2的表达。IFA结果表明,CaIFN-α2可在昆虫细胞中表达,SDS-PAGE和Western blot均检测到25和28 kDa的表达产物。利用MDCK/VSV系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性,表达的重组CaIFN-α2能够有效抑制VSV对MDCK细胞的攻击,细胞裂解物的抗病毒活性为5.58×105 U/mL。试验3、犬融合干扰素α2在昆虫细胞的表达将编码犬血清白蛋白(Alb)基因与CaIFN-α2成熟蛋白基因用柔性肽(GGGGS)连接,并在犬血清白蛋白基因N端接入蜂素信号肽基因(HBM)。将合成的融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2插入pFastBacI载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2,并转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2。重组杆状病毒传至第3代后,用P3代感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析重组犬融合干扰素α2的表达。IFA结果表明,重组犬融合干扰素α2可在昆虫细胞表达;SDS-PAGE和Western blot均检测到上清培养物存在90 kDa的表达产物,表明获得分泌性表达,符合预期结果。用MDCK/VSV系统检测重组犬融合干扰素a2的抗病毒活性,表达的重组犬融合干扰素α2对MDCK细胞遭受VSV的攻击具有抑制作用,细胞培养上清的抗病毒活性为 1.78×104U/mL。