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目前,聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料（PET）的广泛使用已对生态环境造成严重污染,而焚烧和化学降解等方法带来的二次污染同样严峻,因此更为温和的生物降解为PET的回收提供了可能性。据报道来源于Ideonella sakaiensis的塑料降解酶PETase表现出比其他酶更高的PET水解活性。枯草芽孢杆菌是公认的生物安全性菌株,且具有强大的分泌能力,是良好的异源基因表达宿主。在基因表达中,启动子是直接影响基因表达水平的重要基因组调控元件,而信号肽则决定了蛋白的外泌能力。所以外源基因的成功高效率表达不仅要选择合适的宿主菌株,合适的启动子和信号肽同样重要。在本研究中,我们利用枯草芽孢杆菌对PETase进行外泌表达,并选择了5个信号肽和2个启动子来介导PETase的胞外分泌,并以天然信号肽SPPETase作为对照。通过正交设计,构建了7株工程菌,分别是:WB600-P43-SPAprE,WB600-P43-SPapr,WB600-P43-SPBprA,WB600-P43-SPSacC,WB600-P43-SPamy,WB600-P43-SPPETase和WB600-Pylb-SPamy。由于PETase在40°C容易被快速降解,所以对工程菌的培养温度进行了筛选,发现28°C时菌体生长快且48小时之内酶活几乎不会下降。信号肽之间比较发现amy信号肽的外泌效果是天然信号肽的4.5倍,而其它四个信号肽apr、SacC、BprA、AprE的外泌效果也均比天然信号肽效果显著。然后通过P43与Pylb启动子对PETase外泌表达酶活的比较发现,弱启动子P43的效果比强启动子Pylb要高15%,可能是由于弱启动子为外源基因的转录和蛋白质折叠提供了更充足的时间,因此P43和amy是在枯草芽孢杆菌中外泌表达的PETase的最优组合。进一步的实验结果表明P43和amy介导分泌的PETase在2个小时内,能够降解80%的BHET（PET单体）,且当其与PET膜相互作用时,36小时内在扫描电镜下能明显观察到PET膜被腐蚀。对于在枯草芽孢杆菌中外源表达的PETase,这也是首次发现比天然信号肽外泌效果更显著的信号肽。但是由于PET的玻璃化转变温度高于70°C,使得降解PET的过程需要在高温下进行,而PETase在40°C下很容易被降解,它的低热稳定性构成了PET实际酶促降解的瓶颈,所以提高PETase的热稳定性也尤为重要。本研究通过机器学习构建模型,并以PETase为研究对象,统计出了ΔTm提高的突变,去除其保守区域,设计了19个突变体,对PETase的结构进行了改造,并最终获得9个Tm值提高0.5°C以上的突变体,其中S136Q突变体Tm值提高了1.56°C,最适温度提高5°C,且在50°C保温60 min后酶活仍高达79.1%,是野生型的1.5倍。本研究通过对信号肽与启动子的筛选显著提高PETase在枯草芽孢杆菌中的外源表达量,为PETase酶制剂工业化应用提供了有效借鉴。此外基于半理性设计,PETase的热稳定性等酶学性质得到改善,为PETase的工业化应用奠定了一定的理论基础。