细菌超抗原(Bacterial Superantigen，SAg)是一类强有力的T细胞激活剂，主要包括金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)如：SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE及毒性休克毒素综合症1(TSST1)等，可以在MHC II类分子非限制性辅助下，以特异性TCR Vβ的方式激活比普通抗原多达上千倍的CD4’和CD8+T细胞，促使它们增殖和分泌细胞因子，杀伤表达MHCⅡ类分子的靶细胞。虽然超抗原具有较好的抗肿瘤作用，但是它并不能直接用于肿瘤治疗，因为大多数肿瘤细胞并不表达MHCⅡ类抗原；同时，表达MHCⅡ类分子的正常细胞如抗原递呈细胞(APC)也可能成为超抗原的靶细胞而受到攻击，导致严重的副作用。 为了使超抗原发挥特异性的抗肿瘤免疫刺激作用，Dohlsten研究小组通过基因工程的方法，制备了抗人结肠癌单抗的Fab段与SEA的融合蛋白C215Fab-SEA和C242Fab-SEA，并研究了其抗肿瘤作用。结果表明：融合蛋白(Fab-SEA)对MHCⅡ类分子的亲和力不及原来SEA的1／100，这样使得超抗原依赖的T细胞介导的细胞毒作用(SDCC)对MHCⅡ类分子的依赖性大大降低，而与表达肿瘤抗原C215或C242的肿瘤细胞具有很强的结合力，因此，大量激活的T细胞积聚于肿瘤细胞局部，SEA在局部发挥了强烈的免疫刺激作用，显示了较好的抗肿瘤作用。 尽管McAb靶向的超抗原在一系列实验肿瘤的治疗中显示出是一个非常有潜力的肿瘤生物治疗制剂，然而，其本身尚存在一些不足之处，最为突出的缺点是：McAb靶向超抗原的抗肿瘤谱很窄，一种McAb只能靶向表达特异性抗原的肿瘤组织，以致于限制了它的应用。陪以贝赵兢厘SEA融合吕白的扛肿们作用研宛 马文学 Shiminu等使用 SuffO－GMBS交联剂使 SEB结合在 MM A肿瘤细胞表面：结合了SEB的 M6th A肿瘤细胞在体外与 T细胞共同孵育，能有效地刺激 Vps汀细胞的增殖，肿瘤细胞生长明显受到抑制。用结合了SEB的肿瘤细胞免疫小鼠，对肿瘤细胞的攻击具有很强的保护作用；将其用于荷瘤小鼠的治疗，可使生存期得以延长。但是，化学偶联的稳定性欠佳。 Shrayer等将SEA转染B16肿瘤细胞作为肿瘤疫苗，虽然得到了较好的疗效，但是SEA本身是分泌型的，直接用SEA转染的肿瘤疫苗用于治疗，将无法避免分泌型SEA所带来的全身性毒副作用。 针对超抗原的研究现状以及存在的问题，本研究的目的在于：（）构建跨膜型超抗原SEA的原核表达系统（pET28a－TM－SEA），制备跨膜型SEA融合蛋白；（2）研究跨膜型 SEA融合蛋白的锚定及刺激了细胞的增殖活性。（3）研究跨膜型超抗原 SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗作用，以及该肿瘤疫苗对亲本肿瘤细胞攻击的免疫保护作用。本研究共分为三个部分：第一部分：跨膜型超抗原SEA k合基因的克隆及其表达载休的构建 提取金黄色葡萄球菌（ATCC 13565）的基因组DNA作为模板，用两条针对SEA全长基因特异性的引物，通过＊OR方法克隆＊EA基因：用＊mz。冈N式剂从表达＊一戍卜82癌基因的卵巢癌细胞系Hey8910细胞中提取其总RNA，以其逆转录产物。DNA为模板，用两条针对CredsBZ基因序列中编码跨膜（Transmembrane，TM）区片段的特异性引物，PCR扩增 TM片段；采用剪接重叠延伸（SPlicing Overlap Extension，SOE）法连接 SEA和 TM两个基因（片段）；融合基因 TM－SEA与克隆载体 PGEM－了定向连接。经测序证实后，将含有正确重组的 pGEMAITM6EA质粒 DNA和 pET28a质粒 DNA分别用 Nhe和 Hind川双酶切，回收TM6EA融合基因及 pET28a线性质粒，T4 DNA连接酶连接后转化 E．COIi BL21（DE3）pLySS，筛选阳性重组子，完成亚克隆，构建原核表达载体pET－28a－TMSEA。同样地，亚克隆时与SEA基因匹配的表达载体为pET－28bVeCtr，构建超抗原SEA的原核表达载体pET28asEA。 WSL：～WWdswrtwde ＄卜厄羹超扛原SEA融台岳自的扎肿瘤作用研兜 马文学第二部分：跨膜型超抗原SEA t合蛋白的表达与纯化 将第一部分实验构建的表达载体 pET－28aHM－SEA和 pET－28MEA转化 E．ColtBL21（DE3）pLySS，筛选阳性重组子，扩增后提取其质粒 DNA，双酶切鉴定后，获得表达目的蛋白的工程菌sea Voea）p轴刀日】扭门W旧巳和ecal（oes）pLyS 刊曰A’一。 在30t、终浓度为lmM的IPTG条件下诱导目的蛋白的产生，分别在诱导后for，3hr，shr和7hr各取出lml的诱导样本。根据目的蛋白的大小，制备12％的SDS－PAGE分离胶，Western BI。t分析结果发现最佳表达时间约为诱导后shr。同样地，大量制备该融合蛋白的表达样本，在诱导shr后收获工程菌，以备纯化之用。 本研究中产生的目的蛋白标签为 6XHisTgg，采用 NINTA His．Bind Resin纯化系统纯化该目的蛋白。纪三部分：跨膜型超抗原SEA融合蛋白的功能研究一休外实验（In vitro）1．TM6EA t合蛋白对肿瘤细胞膜的锚定作用（1）免疫组化法 纯化的TM－SEA融合蛋白与人大肠癌Colrv205细胞共同孵育4hr后，兔疫组化方法（DAB染色）