环状RNA_0004435对乳腺癌细胞功能的影响及潜在ceRNA网络探索

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目的:2020年最新的癌症报告数据显示,乳腺癌已经成为全球第一大癌,探寻乳腺癌相关的生物学标志物具有十分重要的意义。随着高通量测序以及生信技术的发展,大量的非编码RNA被发现,其中环状RNA作为新兴的非编码家族的一员,备受关注。环状RNA可竞争性与miRNA结合,参与调控多种肿瘤的癌变进展。在本课题中,我们希望通过生信分析,找到一个在乳腺癌中从文报道过的差异表达的环状RNA,并对其发挥的功能作以探索。进一步,预测其竞争性结合的miRNA及下游mRNA,探索该circRNA可能发挥效应的通路,构建一个circRNA的ceRNA网络。方法:本研究可被分成两部分:1.生物信息学分析:下载GEO数据库中数据集GSE101123和TCGA中乳腺癌数据集。基于GSE101123数据集分析出在乳腺癌中差异表达的环状RNA并作为本研究的主要研究目标。接着,我们应用miRanda,starbase,Targetscan软件对目标circRNA下游的miRNA以及mRNA进行预测,构建了circRNA的ceRNA调控网络,然后通过KEGG富集分析的方法探索了该网络可能发挥作用的通路并探索其预后价值。2.实验部分:是对先前分析结果的验证及探索。首先,应用实时定量PCR,分别在组织及细胞水平上验证该circRNA的差异表达。利用Pearson分析方法,探索该circRNA与患者临床资料间可能存在的关联。采用CCK8,transwell,平板克隆这三种细胞功能学实验方法,探索该环状RNA对乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移能力的影响,最后应用western blotting验证先前预测的调控网络中的靶基因及通路中的关键蛋白的表达水平。结果:GSE101123数据集中筛选出在不同类型乳腺癌中均下调的环状RNA_0004435;预测出下游miRNA:miR-196a-5p且TCGA数据验证miR-196a-5p在乳腺癌中高表达(P=6.9e-20);miR-196a-5p下游mRNA的富集分析结果中在MAPK通路中的基因数目最多,选择其中在乳腺癌中低表达(P=1.2e-48)且有预后意义(P=0.028)的mRNA--CACNA2D1作为靶基因,乳腺癌中CACNA2D1的表达与miR-196a-5p负相关(r=-0.081;P=7.49e-03);环状RNA_0004435在乳腺癌中的表达量明显低于癌旁上皮组织(P<0.0001);该环状RNA在高ki-67组的表达量要低于低ki-67组(P=0.0311);环状RNA_0004435在MCF-7和MDA-MB-231中表达低于MCF-10A(P<0.001);CCK8,平板克隆实验结果显示OE组的MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖均低于NC组(P=0.0006;P=0.0253),SI组的MCF-7和MDA-MB-231增殖能力均高于NC组(P=0.0196;P=0.0098);transwell实验结果显示,OE组的MCF-7和MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力均低于NC组(P=0.0039;P=0.0318),SI组的MCF-7和MDA-MB-231细胞的能力均高于NC组(P<0.0001);western blot结果显示,OE组的MCF-7和MDA-MB-231细胞中CACNA2D1,ERK1/2含量相较于NC组,均显著升高;SI组的MCF-7和MDA-MB-231细胞中CACNA2D1,ERK1/2含量相较于NC组均降低。结论:环状RNA_0004435在乳腺癌细胞中表达显著降低,其低表达与ki-67有关;环状RNA_0004435可以抑制乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移;构建环状RNA_0004435—miR-196a-5p-mRNA的MAPK信号传导通路相关的ceRNA调控网络;其中,初步验证环状RNA_0004435—miR-196a-5p-CACNA2D1可能通过影响MAPK通路,进而影响乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移。
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