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ATP合酶(F0F1-ATPase)是一个旋转的生物分子马达，负责生物体内的能量转化。它由嵌于膜内的F0(ab2Cn)和突出膜外的F2(α3β3γδε)两部分组成。 ATP合酶既能利用跨膜质子梯度合成ATP，又能水解ATP而转运质子。光合载色体(chromatophore)是光合细菌质膜内陷形成的外翻囊泡。Chromatophore膜上含有ATP合酶，是研究质子转运性质和ATP合成与水解的重要工具。本文以光合菌中提取的chromatophore为材料，对ATP合酶的亚基特征以及它在生物传感器中的应用进行了研究。具体内容如下：
1.外力驱动下δ缺失的ATP合酶单分子旋转及质子转运观测。目前关于F1-ATPase的可逆旋转行为以及旋转机制已经获得了较好的研究，但完整的F0F1-ATPase中的亚基旋转，特别是亚基旋转及质子转运的偶联关系，研究得还不够清楚。本文以重组chromatophore为材料，建立了一个外力驱动下单分子旋转和质子转运观测系统。首先用超声的方法在重组chromatophore内部标上pH敏感的荧光探针F1300。接着通过β亚基上组转运氨酸标签(His-tag)，在F0F1-ATPase上连接了一个Ni-NTA包被的磁球(直径250 nm)。然后用一个方向和转速可调的磁场来驱动磁球旋转，磁球旋转带动F0F1-ATPase的旋转，观察和记录旋转过程中chromatophore的荧光变化，就可以得出F0F1-ATPase质子转运与旋转之间的关系。该实验从单分子水平上证明了F0F1-ATPase c亚基的旋转与质子转运之间的偶联关系，并计算出当磁场旋转速率为0.33 Hz时，F0F1-ATPase旋转一周质子转运数为4.15±0.2 H+。
2.ATP合酶β亚基与单克隆抗体结合位点研究。研究发现，当ATP合酶β亚基上连接β亚基单克隆抗体等多种负载时，它的合成活性发生改变。当负载比较低时，ATP合酶合成活性受抑制，当负载增加到一定程度(如连上H9病毒)时，ATP合酶合成活性不受抑制反而升高。β亚基上的负载通过怎样的机制来影响合成活性?是通过β亚基抗体结合在活性部位直接抑制ATP合酶合成活性，还是通过结合在非活性部位间接调控ATP合酶合成活性?为了确认β亚基抗体是否直接结合到β亚基催化活性结构域，从而直接影响ATP合成活性，我们从光合菌R.palustris中克隆和表达了β亚基各基因片段，并研究了它们和β亚基抗体的结合情况。β亚基包含三个结构域，中间部分为催化活性结构域。根据β亚基的基因序列和结构域的划分设计引物，然后PCR扩增得到各种β亚基基因片段，将它们克隆到表达载体pET-30a(+)中，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，IPTG诱导表达后，经Ni2+-NTA亲和柱层析纯化重组蛋白。最后，Western Blotting鉴定单克隆抗体4E7与β亚基片段的结合情况。结果表明，β亚基抗体结合的位置不是ATP合成酶的催化活性结构域(结构域2)，而是结合在第一个结构域。这表明β亚基抗体不是通过直接结合到β亚基催化活性结构域，来影响ATP合成活性和质子转运。
3.建立了一个ATP合酶免疫旋转生物传感器并检测了小分子物质k粉。ATP合酶作为旋转分子马达，有巨大的潜在应用价值。根据前面的研究发现，在β亚基上连接单克隆抗体会改变ATP合酶的合成活性和质子转运，进一步研究发现，在ATP合酶β亚基上连接不同分子量的负载时，可以不同程度影响其质子转运。也就是说根据质子转运情况能反映出β亚基上的负载量，根据这一原理，我们以荧光标记的chromatophores为材料建立一个超灵敏的生物传感器并用它检测了k粉。我们首先在chromatophores膜内标上荧光探针F1300用于表征ATP合成引起的质子转运，然后在ATP合酶的β亚基连接上β亚基抗体-生物素-亲和素-生物素-k粉抗体。通过比较待测样品和对照，在ATP合成过程中的荧光增长曲线，可以对样品中的k粉进行定性和定量。用这种方法，测定了四种浓度不同的k粉样品(10-6，10-8，10-10，10-12mg/ml)，最低检测极限为10-10mg/ml，它比常规方法灵敏上万倍。
4.建立了一个精确检测单细胞ATP释放的新型生物传感器。细胞在受到外界各种刺激时往胞外释放ATP分子，释放的ATP通过结合细胞表而的核苷酸受体参与各种信号通路和生理过程。检测ATP的释放具有重要意义。本文建立了一个简便灵敏的方法在荧光显微镜下实时监测单个细胞ATP的释放。首先将DHPE标记到chromatophores，然后通过微印刷技术使chromatophores形成微阵列，用微阵列研究了荧光淬灭和ATP浓度的关系。借助于F0F1-ATPase的水解活性，还发现了ATP对DHPE标记的chromatophores荧光淬灭具有可逆性。根据荧光淬灭和ATP浓度的关系，检测了细胞往外释放ATP的过程中单个细胞表面附近的ATP浓度。还发现ATP类似物oxidized ATP存在时，单个Raw264.7细胞表面的ATP浓度高于对照，更接近于实际浓度。我们的生物传感器不仅能检测胞外ATP浓度，将米还可能用于胞内ATP的实时检测。