第一部分 胰腺导管腺癌lncRNAs差异表达谱的筛选及验证[背景]胰腺导管腺癌是一种难治性恶性肿瘤。早期缺乏特异性症状和体征,一旦出现症状和体征,肿瘤多数已进展至晚期。另外其复杂的解剖特点和独特嗜神经特性也决定了该肿瘤根治性手术切除困难、切除率较低,切即使手术切除,文献报道其5年生存率也不足5%。胰腺癌对放化疗不敏感,一旦复发转移,更缺乏有效的治疗手段。因此为了改善胰腺癌的预后,亟待开发胰腺癌早期诊断的分子标记物和治疗靶点。虽然近20年来,关于胰腺癌的遗传分子研究取得很大进展,但并未开发出有效的诊断标记物和治疗靶点。近年来研究发现非编码RNA广泛参与正常生理及病理生理过程的调控,和肿瘤的关系密切。其中长链非编码RNA (long noncoding RNA,lncRNA)在恶性肿瘤中的研究取得很多令人鼓舞的的进展,该类研究也极大的丰富了表观遗传研究的内容。lncRNAs在胰腺癌中的研究刚刚起步。因此深入研究lncRNAs在胰腺癌发生发展中的作用,将有助于深入认识胰腺癌发生发展的机制,为改善胰腺癌诊治水平开辟新思路。[目的]研究lncRNAs在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达特征,预测差异表达lncRNAs在胰腺癌组织中基因异常表达的调控作用。[方法]采用Human LncRNA Array v2.0 (8×60 K, Arraystar)芯片对6对胰腺癌组织及癌旁组织标本中的转录本进行高通量筛查,确定胰腺癌中的lncRNAs和mRNAs差异表达谱。然后采用qPCR在61例胰腺导管腺癌、20例胰腺浆液性囊腺瘤、14例实性假乳头状瘤、10例神经内分泌瘤及12例十二指肠乳头腺癌的癌组织和癌旁组织中对5个差异表达的lncRNAs, AC09011013.1、CXCR2P1、 PPY2、HOXA11-86、DKFZp434J0226进行验证。采用GO.Pathway及编码非编码基因共表达网络等生物信息学方法对差异表达mRNAs的功能及差异表达lncRNAs对胰腺癌组织中基因异常表达的调控作用进行分析,并为进一步的研究奠定基础。[结果]芯片杂交数据分析显示,在6对胰腺癌组织和癌旁组织之间,表达差异倍数>2,p≤0.05的lncRNAs有291个,其中上调的53个,下调的76个。聚类分析显示,291个差异表达的lncRNAs能够区分癌组织和癌旁组织。其中91个lncRNAs在6对标本中的变化与总体结果一致,其中34个上调,57个下调,显示了较高的特异性。在61对胰腺癌组织和癌旁组织中用qPCR检测了5个lncRNAs, AC09011013.1、CXCR2P1、PPY2、HOXA11-86、DKFZp434J0226表达情况,验证了芯片结果的可靠性。AC09011013.1、DKFZp434J0226在胰腺癌组织中的表达差异具有特异性；HOXA11-86在除实性假乳头状瘤外的其他三类非胰腺癌肿瘤组织中的表达也显著升高；PPY2在神经内分泌肿瘤组织中显著升高、CXCR2P1在浆液性囊腺瘤组织中显著降低。在6对胰腺癌组织及癌旁组织中检测到222个蛋白编码基因存在显著表达差异,其中上调的66个,下调的156个。GO分析显示,上调的66个基因涉及到的主要生物过程是“营养过度应答(response to dietary excess)",细胞成分是“核小体(nuclesome) ",分子功能是“二磷酸尿苷-半乳糖转移酶活性(UDP-galactosyltransferase activity)";156个下调的基因所涉及的生物过程是“免疫系统进程(immune system process)",细胞成分是“细胞外区域(extracellular region)",分子功能是“趋化因子受体结合(chemokine receptor binding)"。 Pathway分析显示差异表达的基因主要分布在粘多糖合成及硫酸角质素相关的(glycosaminoglycan biosynthesis-keratan sulfate)糖基复合物代谢通路中及金黄色葡糖球菌感染相关的信号调节通路中。编码和非编码RNA共表达调控网络分析显示AC091013.1、CXCR2P1和DKFZp434J0226具有更多的相关基因。而HOXA11-86和PPY2相关基因数较少。[结论]在胰腺癌组织及癌旁组织中存在lncRNAs和mRNAs表达差异。差异表达的蛋白编码基因主要集中在和细胞代谢、免疫生物过程,与核小体及细胞外区域密切相关,涉及趋化因子结合及UDP-半乳糖转移酶等分子功能。长链非编码RNA-AC091013.1和DKFZp434J0226在胰腺癌组织中的表达差异具有特异性,并且具有更多的相关基因,可能具有更重要的功能。第二部分胰腺导管腺癌差异表达lncRNAs的临床意义[背景] 癌症转录组较我们的认识要复杂的多,除了蛋白编码基因、microRNA外,lncRNA的表达异常在人类恶性肿瘤中普遍存在,与肿瘤的发生有密切的关系。虽然我们对lncRNA还知之甚少,但从既往的研究推断,lncRNA参与了肿瘤的发生发展,可能成为恶性肿瘤诊断、预后判断的新分子标记以及改善肿瘤治疗效果的新分子靶标。在某些肿瘤发生的早期,lncRNA可通过介导转录水平的基因沉默途径调控癌相关蛋白的表达。此时,lncRNA的早期诊断价值更大,因为这时肿瘤组织较小,在影像学上难以分辨。HOTAIR高表达的乳腺癌患者组的无瘤生存期和总生存期均明显低于低表达组；多因素分析结果进一步说明它是乳腺癌转移和预后差的独立危险因素,HOTAIR被认为是乳腺癌诊断和预后判断的一个重要标志物。而降低细胞内HOTAIR的表达水平能够抑制乳腺癌细胞(特别是PRC2过度活跃的癌细胞)的侵袭能力,提示HOTAIR可能成为乳腺癌治疗的分子靶点。因此,在肿瘤细胞发生表观遗传调控差错时,利用lncRNA来纠正这种差错便有可能将肿瘤细胞扼杀在摇篮里,从而达到早期治疗肿瘤的目的。也有研究发现HOTAIR可以促进胰腺癌细胞的增殖。但迄今关于胰腺癌相关lncRNA缺乏系统深入的研究。因此在本部分将对胰腺癌中差异表达的lncRNAs进行扩大样本验证,结合临床资料进行评价,判断其在临床预后判断中的价值。[目的]评价AC091013.1和DKFZp434J0226和胰腺癌临床病理参数之间的关系,以及对临床预后的判断价值。[方法]选取符合入组条件的胰腺癌病例109例,用qPCR的方法检测AC091013.1和DKFZp434J0226在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况,结合临床病理参数及预后资料进行统计分析。分别使用方差分析、chi-squared检验及双侧T检验对数据进行统计分析。危险因素的估计使用logistic回归的方法。Kaplan-Meier及log-rank分析用于胰腺癌病人生存率统计及比较。胰腺癌病人预后因素的检测使用COX回归的方法。[结果]全组109例胰腺癌病例,中位无瘤生存时间(DFS)是324天,中位总生存时间(OS)是370天。Log-rank检验发现TNM分期(x2=9.486,P=0.002)、肿瘤大小(x2=8.738,P=0003)和淋巴结转移(χ2=7.152,P=0.028)及年龄(χ2=5.975,P=0.015)影响患者的无瘤生存时间；TNM分期(χ2=6.741,P=0.009)、淋巴结转移(χ2=5.322,P=0..21)及年龄(χ2=6.684,P=0.010)影响患者的总生存时间。COX模型分析影响患者OS的预后因素,发现年龄和淋巴结转是预测死亡的独立因子。109例胰腺导管腺癌病例中AC091013.1高表达的56个,低表达的53个单因素卡方检验显示两组在性别(χ2=5.814,P=0.016)和血管受侵犯(χ2=5.58,P=0.018)的比例上有显著差异。多因素logistic回归分析也显示性别和血管浸润和AC091013.1的表达相关。并且性别和血管浸润是AC091013.1表达高低的独立危险因素(性别：OR=0.337,P=0.009；血管浸润：OR=0.290,P=0.011)。Log-rank检验发现：AC091013.1高表达组和低表达组之间无论是在无瘤生存时间、还是在总生存时间上差异都不具有统计学意义。109例胰腺导管腺癌病例中DKFZp434J0226高表达的54个,低表达的55个。单因素卡方检验显示两组在肿瘤分化(χ2=8.363,P=0.015)、神经浸润(χ2=16.048,P=0.001)和TNM分期(χ2=3.993,P=0.046)的构成比例上有显著差异。多因素二元logistic回归分析也显示神经浸润和DKFZp434J0226的表达呈正相关,并且是DKFZp434J0226表达高低的独立危险因素(OR=5.963,P<0.001)。进一步log-rank检验发现DKFZp434J0226低表达组无论是无瘤生存时间还是总生存时间均显著优于高表达组(DFS：低表达组VS高表达组为388.000±15.889vs 80±25.107,χ2=6.701,P=0.010;OS:低表达组VS高表达组为416.000±14.830 vs 320±12.247,χ2=8.734,P=0.003)COX模型分析显示DKFZp434J0226是胰腺癌复发转移和死亡的独立预测因子(DFS:OR=1.68,P=0.037;OS:OR=1.891, P=0.009), DKFZp434J0226高表达组比低表达组复发转移的风险高1.68倍,死亡风险高1.891倍。[结论]长链非编码RNA-AC091013.1在胰腺癌组织中表达的高低和性别及血管侵犯相关,但对胰腺癌患者的无瘤生存期和总生存期无影响。长链非编码RNA-DKFZp434J0226与神经浸润显著相关；DKFZp434J0226低表达组无论是无瘤生存期还是总生存期均显著优于高表达组；COX模型分析显示DKFZp434J0226是胰腺癌复发转移和死亡的独立预测因子。DKFZp434J0226高表达组比低表达组复发转移的风险高1.68倍,死亡风险高1.891倍。第三部分LncRNA-DKFZp434J0226在胰腺癌细胞侵袭能力的影响[背景]长链非编码RNA的作用机制非常复杂,几乎可以在转录、转录后可变剪切、蛋白质翻译、翻译后修饰、蛋白质的运输、定位和最终的激活各个层次进行调节,他们还可以miRNA前体、内源性siRNA、蛋白质作用骨架等多种形式参与调控。对细胞的增殖、凋亡、侵袭转移、耐药等多种行为能力均有影响。但是又由于其在长度和结构上不同与miRNA,使其机制研究相当复杂。[目的]研究长链非编码RNA-DKFZp434J0226对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响,及其分子机制。[方法]先用qPCR的方法检测lncRNA-DKFZp434J0226在MIAPaCa-2、 Capan-1和PANC-1胰腺癌细胞株中的表达情况,将表达最高的细胞株选定为研究对象。同时构建DKFZp434J0226敲除的稳转细胞株。用划痕试验和Transwell侵袭实验比较基因敲除后细胞迁移、侵袭能力的变化。再用qPCR和Western blot的方法检测MMP-9和VEGF的表达变化。[结果]在MIAPaCa-2、Capan-1和PANC-1三株细胞中,DKFZp434J0226在MIAPaCa-2中的表达最高。构建lncRNA-shRNA敲除稳转细胞株中DKFZp434J0226表达显著下调超过90%。划痕试验及Transwell侵袭实验提示DKFZp434J0226敲除以后细胞的迁移及侵袭能力显著降低。QPCR和western blot显示细胞内MMP-9和VEGF的表达水平显著降低。[结论]在MIAPaCa-2细胞中敲除DKFZp434J0226后可以抑制细胞的侵袭迁移能力,其机制可能与下调细胞内MMP-9和VEGF的水平有关。