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目的探讨CD137-CD137L信号(简称CD137信号)是否通过外泌体介导NFATc1促进动脉粥样斑块钙化的形成。方法1.构建小鼠动脉粥样硬化模型:使用载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠高脂饮食喂养建立小鼠动脉粥样硬化模型,尾静脉途径注射外泌体。2.透射电子显微镜:观察Apo E-/-小鼠斑块中外泌体表达情况以及鉴定分离提纯的微囊泡。3.纳米颗粒示综分析(NTA)和BCA法:纳米颗粒示踪分析各平滑肌细胞处理组外泌体的直径和浓度分析比较,BCA法测定蛋白。4.细胞免疫荧光:用PKH-26免疫荧光标记法标记示踪外泌体,观察其被平滑肌细胞内吞情况。5.构建沉默NFATc1的细胞株:构建沉默NFATc1基因及对照的GFP-慢病毒载体,慢病毒包装,感染细胞,培养筛选细胞系,分别命名为沉默NFATc1细胞株和对照细胞株。6.Western blot技术:检测CD63、CD81外泌体表面标记物,NFATc1总蛋白表达水平,骨形成蛋白2(BMP-2)抗体和runt相关转录因子2(Runx-2)抗体、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等相关蛋白。7.免疫组化染色:分别使用免疫组化染色方法观察各组外泌体干预后斑块内NFATc1,Runx-2,BMP-2表达变化。8.细胞及组织钙化检测:试剂盒检测血管平滑肌细胞中细胞碱性磷酸酶活性;细胞及组织中钙含量测定,Von kossa染色检测血管平滑肌细胞及血管组织块钙化情况。结果1.CD137信号对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内外泌体表达的影响:透射电子显微镜观察结果显示:CD137信号激动组与对照组相比Apo E-/-小鼠斑块中外泌体的数量显著增加(P<0.01)。2.CD137信号对血管平滑肌细胞外泌体分泌的影响:NTA结果提示:CD137信号激动组平滑肌细胞外泌体浓度显著高于对照组(P<0.01)。BCA结果显示:CD137信号激动组平滑肌细胞与对照组相比外泌体总蛋白含量显著增加(P<0.01)。3.CD137信号对血管平滑肌细胞和外泌体中NFATc1表达的影响:CD137信号激动组与对照组相比平滑肌细胞NFATc1的表达显著增加(P<0.01)。且与对照组相比,CD137信号激动组外泌体与对照组外泌体相比NFATc1的表达显著增加(P<0.01)。在CD137信号激动后,相较对照细胞株(PLKO.1-sh GFP),沉默NFATc1的细胞株(PLKO.1-sh NFATc1)细胞和外泌体中NFATc1的表达显著减少(P<0.01)。4.各组外泌体干预对平滑肌细胞钙化的影响:蛋白质印迹结果显示CD137信号激动组外泌体处理组与对照组外泌体处理组相比VSMCs中α-SMA蛋白的表达降低(P<0.01),同时BMP-2和Runx-2的表达显著增高(P均<0.01)。CD137信号激动+沉默NFATc1外泌体组与CD137信号激动组相比α-SMA蛋白表达显著增高(P均<0.01),BMP-2和Runx-2蛋白表达显著下降(P均<0.01)。Von kossa染色结果显示CD137信号激动组外泌体处理组与对照外泌体组比较黑色钙颗粒沉积显著增多。沉默NFATc1+CD137信号激动组外泌体处理组与CD137信号激动组外泌体处理组比较黑色钙颗粒沉积显著减少。CD137信号激动组外泌体处理组与对照外泌体组比较黑色钙颗粒沉积显著增多(P<0.01)。沉默NFATc1+CD137信号激动组外泌体处理组与CD137信号激动组外泌体处理组比较黑色钙颗粒沉积显著减少(P<0.01)。5.各组外泌体干预对Apo E-/-小鼠动脉粥样斑块的影响:免疫组化及Masson染色结果显示,CD137信号激动外泌体组与对照外泌体组比较小鼠主动脉斑块面积增加,及斑块内成骨表型指标BMP-2、Runx-2阳性表达增多(棕色即为阳性标记),而CD137信号激动+沉默NFATc1外泌体处理组相比CD137信号激动外泌体组相比主动脉斑块面积减少,斑块内BMP-2和Runx-2阳性标记均减少。各组Apo E-/-小鼠主动脉血管Von kossa染色显示与对照外泌体处理组比较,CD137信号激动外泌体处理组中小鼠主动脉钙化面积增加,而CD137信号激动+沉默NFATc1外泌体处理组相比CD137信号激动组外泌体主动脉钙化面积减少。结论CD137信号激动可促进血管平滑肌细胞外泌体的分泌,并可能通过外泌体传递NFATc1信号促进血管平滑肌细胞钙化及Apo E-/-小鼠动脉粥样斑块钙化发生。