海洋细菌PD--2抑藻活性研究及群体感应基因zlb I敲除方法的建立

来源 :国家海洋局第一海洋研究所 | 被引量 : 3次 | 上传用户:liulang75281899
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海洋环境中的溶藻细菌是一类对海洋微藻生长具有抑制作用,能裂解或直接杀死藻细胞的细菌。研究溶藻细菌的功能与机制是藻菌作用关系的热点问题,对探讨赤潮的生物治理等关键科学问题具有重要的指导意义。本文以一株微藻共栖细菌Rhodobacteraceae strain PD-2为研究对象,探明了它释放的抑藻物质和作用方式,确定了其群体感应基因,并建立了利用同源重组技术敲除群体感应基因的方法。主要研究内容包括:对微藻共栖细菌Rhodobacteraceae strain PD-2的培养条件进行了优化实验,通过对比不同条件下的细菌密度、抑藻活性,获得最适的培养温度和培养基添加成分。结果表明采用Zobell2216E加葡萄糖培养基,30C的条件下培养细菌密度和抑藻活性最高。利用基于生物传感器的双层琼脂法对PD-2产生的AHLs信号分子的种类进行了初步研究,发现该菌至少可以产生3种AHLs分子,并与标准品比较,其中可能存在新种类的AHLs。应用之前实验获得的最适培养条件对具有抑藻效果的微藻共栖细菌PD-2进行大规模的发酵培养,利用各种化学分离纯化手段与生物活性示踪方法(生物自显影)对其代谢产物中的抑藻活性物质进行分离和纯化,运用一维核磁共振(1HNMR、13CNMR、DEPT)、质谱(EI/MS)等现代波谱分析技术对该抑藻化合物的分子量和结构进行了鉴定。通过与已知文献的对比,抑藻化合物分子式确定为C12H10N2OS,分子量为230.051383,结构式命名:(4,5-dihydrothiazol-2-yl)(1H-indol-3-yl)methanone。通过扫描电镜观察发现抑藻物质可以使藻细胞壁裂解,从而抑制其宿主东海原甲藻的生长。通过对PD-2的全基因组序列进行分析,发现了两对群体感应(lux I/R)同源基因,命名为zla I/R和zlb I/R。为了探明该细菌群体感应的调控功能,开展了基于同源重组技术敲除zlb I基因的方法研究。通过PD-2利福平突变株与大肠杆菌E.coli S17-1pSRK Gm的结合实验,确定PD-2可以与其进行结合,并对结合条件进行了优化。根据zlb I基因序列,设计了该基因上下游片段的扩增引物,扩增获得500bp左右的上下游片段;通过两步PCR技术对两段序列进行了融合扩增;通过限制性酶切和连接技术,将上下游融合片段插入自杀质粒pNPTS138kan中,并将重组质粒转导入E.coli S17-1感受态细胞中,获得了重组大肠杆菌,建立了zlb I基因敲除的技术体系。目前正利用优化的细菌结合条件,将PD-2利福平突变株与含重组质粒的E.coliS17-1进行同源重组,由于同源重组效率较低还未获得结果,该工作仍在继续开展。
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