论文部分内容阅读
背景与目的 在中国,膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤,近年来发病率明显上升。膀胱癌多数以浸润方式生长,复发非常普遍(50%-70%),虽然可以用局部治疗来控制,但仍有10%-15%的表浅性膀胱癌最终发展成肌肉浸润性膀胱癌或者发生转移,特别是晚期膀胱肿瘤患者缺乏有效的治疗方法。膀胱肿瘤的发生、发展涉及多方面机制,比如癌基因激活、抑癌基因失活、肿瘤血管生成、细胞周期调控与信号转导异常、抗凋亡增强、侵袭与转移因子激活、端粒酶激活等。本课题从凋亡的机制来探讨膀胱肿瘤的发生、发展,并试图采用重组融合蛋白联合反义基因措施对膀胱肿瘤细胞进行体外杀伤作用的实验研究。抗凋亡因子survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。近年来的研究表明,survivin可能参与了肿瘤的发生机制,采取措施下调survivin表达可达到抑制肿瘤生长的作用。目前国内外涉及survivin与膀胱肿瘤的研究较少,有待进一步深入探讨。肿瘤EGFR阳性表达被认为是不良分化的重要标志,高水平表达的EGFR可以成为抑制膀胱肿瘤生长的导向攻击目标。大量的研究表明人膀胱癌能高水平地表达EGFR。利用基因工程手段将TGFα cDNA顺序与PE40(绿脓杆菌外毒素)片断cDNA顺序连接,表达出有生物活性的TGFα-PE40融合蛋白(简称TP40)。该蛋白具有与表达EGFR的靶细胞特异结合的能力,因而起着导向的作用,同时携带PE40进入细胞,高效地阻断靶细胞内蛋出质合成,导致细胞死亡。研究表明,TP40对EGFR表达水平较高的肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及脑胶质瘤等细胞的生长有较强的导向抑制作用,并涉及凋亡机制。本课题首先探讨了抗凋亡因子survivin的表达与膀胱肿瘤的关系,进而研究了下调其表达对膀胱肿瘤细胞的抑制作用,最后探讨了联合应用基因重组融合蛋白TGFα-PE40和下调survivin表达对人膀胱癌细胞生长的导向性抑制作用,为膀胱肿瘤的治疗研究提供一条新的途径。第1部分 膀胱移行细胞癌抗凋亡因子survivin表达的免疫组织化学研究目的探讨survivin在膀胱肿瘤的表达情况及其与肿瘤分期、分级和复发的关系。 <WP=6>材料与方法 38例膀胱移行细胞癌患者均有明确病理学诊断,按UICC分类法进行临床分期,其中Ta～1期18例,T2期9例,T3期7例,T4期4例,WHO病理分级为G1级7例,G2级18例,G3级13例。38例标本中14例有配对癌旁组织。8例正常膀胱粘膜取自非肿瘤患者。免疫组织化学染色方法按照试剂盒步骤进行,出现棕黄色胞质和(或)胞核染色区域为阳性,染色强度分为0、1、2、3分,计算表达指数:染色强度评分×阳性细胞所占比例。结果 8例正常膀胱粘膜均未显示移行上皮细胞的阳性survivin染色。38例膀胱移行细胞癌中存在 29 例survivin的阳性表达,阳性表达率76.3%,14例癌旁组织仅2例弱阳性表达。膀胱移行细胞癌组织survivin表达指数(1.131±0.915)明显高于正常组织和癌旁组织(F=15.71,P<0.001)。Survivin在Ta/T1期(浅表性膀胱移行细胞癌)和T2～T4期(浸润性膀胱移行细胞癌)肿瘤的表达指数分别为1.199±0.943和1.243±0.937,但统计学未见相关性(F=0.23,P=0.633)。Survivin在G1/G2级肿瘤和G3级肿瘤的表达指数分别为1.070±0.952和1.249±0.828,统计学亦未见相关性(F=0.33,P=0.569)。38例膀胱平均随访25个月,随访期间共发现7例复发,总复发率18.4%。其中survivin阳性的29例患者有6例复发(20.7%), survivin阴性的9例患者仅有1例复发(11.1%),但两者的差别并无显著性意义(Fisher=0.411)。 第2部分 膀胱移行细胞癌抗凋亡因子survivin拼接变异体的表达研究目的探讨survivin拼接体在膀胱移行细胞癌的表达情况及其与肿瘤分期、分级的关系。材料与方法 有明确病理学诊断的30例膀胱移行细胞癌,按UICC分类法进行临床分期, 其中Ta/T1期17例,T2～T4期13例, WHO分级G1/G2级23例, G3级7例,配对的癌旁组织8例,另有8例正常膀胱粘膜取自非肿瘤患者。膀胱癌组织的总RNA抽提按照TRIzol试剂盒说明进行,取 2μg总RNA逆转录酶合成cDNA,5倍稀释后取 2μl进行PCR, 所有标本用GAPDH mRNA作内对照,目的PCR条带用BIO-RAD Quantity One 4.5.0软件根据面积与吸光度定量分析,每一标本的survivin及其不同拼接体的 mRNA表达用GAPDH标准化,结果表示为survivin及其拼接体mRNA与GAPDH mRNA的比值。结果 <WP=7>30例膀胱癌标本有28例检测到survivin及其拼接变异体(survivin-△Ex3和survivin-2B)mRNA的表达,阳性率为93.3%。Survivin为主要的转录本(0.712±0.120),survivin-△Ex3(0.101±0.029)和survivin-2B(0.214±0.076) mRNA为低水平表达,三者的表达水平有显著性差异(P<0.0001)。8例正常膀胱粘膜均未检测到阳性条带,8例癌旁组织有2例出现阳性条带,与正常膀胱粘膜和癌旁组织相比,膀胱癌组织survivin、survivin-2B和survivin-△Ex3 mRNA的表达水平均明显增高(P<0.0001)。Survivin 和survivin-△Ex3 mRNA的表达与肿瘤的分期、分级未见相关性(P>0.05)。而Survivin-2B mRNA表达水平在高分期、高分级肿瘤明显低于低分期、低分级肿瘤(P<0.0001)。第3部分 基因重组融合蛋白TGFα-PE40对人膀胱癌细胞增殖的研究目的 研究基因重组融合蛋白TGFα-PE40(TP40)对膀胱移行细胞癌T24细胞的