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膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是中老年人的常见病和多发病,但目前治疗手段有限,探讨KOA发病机制,寻找有效治疗或缓解KOA进展的药物,是当今社会亟需解决的问题。电压依赖性钙通道是软骨细胞调控细胞外钙进入细胞内的主要途径,对维持细胞内钙的稳态环境起重要作用。资料显示,钙通道阻滞剂是应用最多的降压药物。是否常用的钙通道阻滞药对KOA的软骨均有保护作用?哪一种或几种药物保护作用最强?动物实验往往研究一种药物,结果并不一致。本研究中,使用ATDC-5软骨细胞系,观察了10种常用的抗高血压的钙通道阻滞剂对IL-1β诱导的软骨细胞合成代谢和分解代谢指标的影响,寻找对软骨细胞基质代谢具有保护效果的钙通道阻滞剂。随后在大鼠KOA模型上,通过qRT-PCR和Western blot方法,对保护效果最好的药物作用进行了验证。方法:1 MTS法测定不同浓度钙通道阻滞剂(硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓、非洛地平、氨氯地平、尼卡地平、乐卡地平、尼群地平、贝尼地平和拉西地平)对细胞增殖影响。2 ATDC-5细胞的诱导:ITS诱导细胞增殖分化7天或14天,qRT-PCR检测软骨标记物相关基因(Col2a1,Aggrecan-1,Col10a1和Sox-9)表达。IL-1β诱导软骨细胞成为OA样软骨细胞,q RT-PCR检测基质代谢相关基因表达。3 10种钙通道阻滞剂对OA样软骨细胞基质代谢的影响:通过q RT-PCR方法研究10种钙通道阻滞剂对OA样软骨细胞基质合成代谢(Col2a1,Aggrecan-1和Sox-9)和分解代谢(Mmp-3,Mmp-8和Mmp-13)基因表达的影响。酶联免疫吸附法验证有保护作用的钙通道阻滞剂对II型胶原蛋白表达的影响。4大鼠KOA模型的制备与鉴定:经典Hulth法制作大鼠KOA模型,4周后取膝关节组织进行大体观察和病理学观察。5正常和KOA大鼠关节软骨细胞基质代谢相关基因表达:取正常大鼠和KOA大鼠关节软骨细胞进行原代培养,q RT-PCR检测基质合成代谢(Col2a1,Aggrecan-1和Sox-9),分解代谢(Mmp-3,Mmp-13,Adamts-4和Adamts-5)基因表达。6硝苯地平对膝骨关节炎大鼠软骨细胞基质代谢的影响:通过q RT-PCR方法研究硝苯地平对膝骨关节炎大鼠软骨细胞基质代谢相关基因表达的影响,Western blot方法验证其对II型胶原蛋白表达的影响。结果:1.10种钙通道阻滞剂对ATDC-5细胞增殖的影响:硝苯地平、非洛地平、地尔硫卓、氨氯地平、乐卡地平、贝尼地平和拉西地平,随着浓度的升高,细胞活性逐渐降低。尼卡地平和尼群地平均在30μM出现细胞毒性,维拉帕米在本实验中未表现出明显的细胞毒性。2.ATDC-5细胞的诱导:ITS诱导14天后,软骨标记物相关基因升高明显,IL-1β可使软骨细胞外基质合成代谢和分解代谢产生OA样变化。3.10种钙通道阻滞剂对OA样软骨细胞基质代谢的影响:低浓度时,硝苯地平逆转IL-1β诱导的OA样软骨细胞基质合成代谢指标Col2a1,Sox-9和分解代谢指标Mmp-3基因表达的变化。地尔硫卓、非洛地平和乐卡地平能够使其Col2a1基因表达升高,维拉帕米、氨氯地平和贝尼地平能够使其Mmp-3,Mmp-8或Mmp-13表达降低。尼群地平和拉西地平能够使Mmp-3,Mmp-8和Mmp-13表达升高。4.大鼠KOA模型的制备与鉴定:大鼠行Hulth法造模4周后,HE染色显示潮线模糊,甲苯胺蓝和番红O着色较浅,出现失染现象。5.正常和KOA大鼠关节软骨细胞基质代谢相关基因表达:OA组基质合成代谢指标(Col2a1、Aggrecan-1和Sox-9)基因表达明显降低,分解代谢指标(Mmp-3、Mmp-13和Adamts-5)基因表达明显升高。6.硝苯地平能够逆转大鼠KOA时Col2a1,Aggrecan-1,Sox-9和Adamts-5的基因表达的变化,并使OA时II型胶原的蛋白表达量明显升高。结论:低浓度时,硝苯地平可同时逆转骨关节炎软骨细胞基质的合成代谢和分解代谢;非洛地平、地尔硫卓和乐卡地平主要使软骨细胞基质合成代谢水平升高;维拉帕米、氨氯地平、尼卡地平和贝尼地平主要降低软骨细胞基质分解代谢水平;尼群地平和拉西地平使软骨细胞的分解代谢加剧。因此,我们推测在10种常见的抗高血压的钙通道阻滞剂中,硝苯地平保护骨关节炎软骨的效果最好。