骨骼肌是体内最大的细胞库,也是常见的免疫应答场所(如肌肉自身免疫疾病、肌内感染、肌肉途径的疫苗和转基因治疗等)。生理条件下,肌卫星细胞和成熟的肌纤维均缺乏MHC分子表达。但有研究证实,体外分离培养的人成肌细胞能表达MHC-Ⅰ (人类白细胞抗原I, HLA class Ⅰ),促炎的细胞因子(如IFN-γ, TNF-α, IL-1α, IL-1β,或MIP-1α)会进一步上调成肌细胞的]HLA-Ⅰ表达。接受IFN-γ刺激后,成肌细胞和分化肌管均表达MHC-Ⅱ分子(HLA class-Ⅱ)。因此有学者指出,骨骼肌细胞是一种兼职的(non-professional)抗原呈递细胞(APC)。体外条件下,成肌细胞表达免疫蛋白酶亚单位(如LMP2, LMP7, MECL1),能够处理内源性抗原(通过MHC-Ⅰ通路)并被CD8+T细胞识别。炎性培养环境中的成肌细胞亦表达与MHC-Ⅱ抗原处理和呈递相关的关键酶(如Cathepsins),参与呈递外源或内源抗原至CD4+T细胞。接受炎性刺激的人成肌细胞持续表达黏附分子(如LFA-1, ICAM-1)和共刺激分子(如ICOS-L, PD-L1, CD40)。上述研究均支持骨骼肌细胞在炎性环境中具备APC功能并参与驱动获得性免疫反应。有关骨骼肌细胞免疫特性的研究均选用人的成肌细胞及分化肌管。罕有文献报道目前广泛应用的成肌细胞株(如C2C12,L6细胞)是否表达MHC分子并具备APC功能。炎性肌病及肌无力患者的骨骼肌细胞本身是自身免疫反应的攻击目标。在肌组织内的免疫应答过程中,肌细胞与炎症反应的相互左右如何,尚待阐明。本研究中,我们尝试将体外增殖或分化培养的C2C12成肌细胞置于IFN-γ诱导的炎性环境中,分析成肌细胞及分化肌管的免疫学特性。结果表明,较之增殖的成肌细胞,分化肌管对炎性刺激更为敏感。INF-γ刺激条件下,分化肌管显著上调MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ及TLR 3/TLR 7分子表达水平。我们发现,INF-γ同时诱导分化肌管上调一些共刺激/共抑制分子(包括CD40、CD86、ICAM-1、ICOS-L及PD-L1)。对ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达的检测表明,IFN-y诱导的肌管内NLRP3炎症小体被活化。相关的促炎细胞因子及趋化因子的mRNA水平在INF-y处理的成肌细胞和分化肌管中均显著上调,包括IL-1、IL-6及MCP-1。采用共培养及T细胞活化实验,我们进一步证实体外炎性培养的分化肌管能促进CD4+、CD8+T的体外增殖。因此,本研究结果表明,肌细胞(尤其是分化肌纤维)在体外炎性环境中能够被诱导表达免疫表型。我们的结果提示,肌细胞能主动参与骨骼肌的炎症/免疫反应。主要研究内容：第一章C2C12细胞的体外培养及分化诱导[目的]采用C2C12细胞,获取激活并增殖的成肌细胞和分化肌管。[方法]常规复苏后C2C12细胞,用含100mg/L青霉素、100mg/L链霉素及体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基接种,37℃、 5%CO2培养箱中增殖培养。观察细胞状态,将生长状态良好的C2C12细胞传代培养,镜下观察,细胞生长达80%时,换用含100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素和体积分数为2%马血清的DMEM/F12完全培养基诱导分化。镜下观察细胞形态。[结果]C2C12细胞在含胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养时,细胞呈梭状,生长较快。换马血清培养3--4天后,镜下可见细胞融合,肌管形成,随时间推移,细胞密度变大,体积增加,多核肌管的数量逐渐增加。[结论]体外常规培养条件下,C2C12细胞生长、增殖良好。马血清诱导能促使增殖的成肌细胞分化并融合为肌管,可用于下一步的实验研究。第二章体外炎性环境诱导成肌细胞／分化肌管表达MHC及TLRs[目的]分析在IFN-γ构建的体外炎性环境中,成肌细胞／分化肌管能否表达主要组织相容性复合体(MHC-Ⅰ/Ⅱ)及Toll样受体3/7(TLR3/7),从而明确肌细胞表达免疫分子的潜能。[方法]将C2C12成肌细胞,或马血清分化的肌管分别培养于添加IFN-γ(0.6ug/ml)的DMEM培养基中。分别于培养后24h及48h,采用免疫荧光、Western blot、 q-PCR及流式细胞术检测细胞的MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、TLR 3/7表达水平,并对比分析。[结果]蛋白印记的检测表明,MHC-Ⅰ分子H-2Kb、Toll样受体3和7(TLR3/TLR7)的蛋白水平在增殖和分化的C2C12细胞均呈现低表达,但IFN-γ刺激导致上述分子表达显著上调。分化肌管中,H-2Kb、TLR3、TLR7的表达水平显著高于增殖的成肌细胞,并于分化48h时达表达高峰。IFN-γ刺激前后, 成肌细胞均不表达MHC-Ⅱ分子H2-Ea。但H2-Ea在分化肌管中呈阳性表达,IFN-γ刺激进一步上调其表达水平。q-PCR、流式细胞术及免疫荧光染色的结果进一步证实在IFN-γ刺激后,分化肌管上调TLR3／7及MHC-Ⅰ/Ⅱ的表达。[结论]体外炎性环境下,肌细胞能表达TLR3／7及MHC-Ⅰ/Ⅱ分子,且分化融合肌管的表达水平显著高于增殖的成肌细胞,提示肌纤维对炎性刺激的反应更为敏感。第三章体外炎性环境诱导成肌细胞／分化肌管表达其他免疫分子[目的]检测IFN-γ能否诱导成肌细胞／分化肌管表达其他炎性分子,如NLRP3炎症小体、相关细胞因子、共刺激／共抑制分子、粘附分子等。[方法]将成肌细胞／分化肌管分别于添加IFN-γ的饥饿培养基／分化培养基中培养,q-PCR检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-18、TGF-β、MCP-1、 MIP-1a、TNF-α的基因表达,流式细胞术检测CD40、CD80、CD86、ICOS-L, PD-L1的表达水平,免疫荧光及Western blot检测细胞炎症小体组分NLRP3、ASC及mature-caspase-1的表达改变。ELISA检测诱导细胞释放IL-1 β的程度。[结果]免疫荧光、qPCR和Western blot检测证实,IFN-y诱导成肌细胞／分化肌管上调NLRP3、ASC和mature-caspase-1表达水平。q-PCR分析显示,未接受IFN-y炎性刺激的成肌细胞和肌管表达促炎的IL-1、IL-6、IL-18及MCP-1,但不表达IL-8及IL-15。IFN-γ则诱导分化肌管显著上调IL-1, IL-6和MCP-1的mRNA水平。IFN-γ诱导成肌细胞和分化肌管上调抗炎的IL-10 mRNA水平,以分化肌管的表达上调更为显著。ELISA结果显示,肌细胞,尤其是分化肌管呈现IFN-γ诱导性IL-1β释放增加。FACS检测证实,C2C12成肌细胞和肌管均表达CD80,但IFN-γ刺激不改变CD80阳性细胞数量。反之,IFN-γ诱导CD86阳性细胞数量增加。未接受刺激的C2C12细胞呈CD40, ICOS-L及ICAM-1的低表达,IFN-γ刺激后阳性细胞数显着增加。此外,IFN-γ诱导PD-L1阳性细胞数量显著增多。[结论]体外炎性环境能诱导成肌细胞／分化肌管表达、或上调NLRP3炎症小体、特定的细胞因子、共刺激/共抑制分子以及粘附分子,使肌细胞,尤其是分化的肌纤维呈现免疫细胞的表型特征。第四章 炎性诱导的分化肌管促进T细胞的活化与增殖[目的]评估炎性诱导的肌细胞是否影响T细胞的增殖改变,从而验证其作为抗原呈递细胞的潜能。[方法]自野生B6小鼠脾脏中分离纯化CD4+和CD8+T细胞并急性CFSE标记,分别将CD4+,或CD8+T细胞与IFN-γ刺激48h的分化肌管共培养,刀豆蛋白刺激T细胞增殖,48h后流式检测T细胞的增殖情况。[结果]Con A能诱导CD4+,或CD8+T细胞体外增殖。 共培养的T细胞增殖效应更为显著。[结论]体外炎性诱导赋予分化肌管免疫表型, 可能通过MHC分子被T细胞识别,从而促进T细胞的增殖。